一種多拉菌素的制備方法

鄧 意，李敬輝，楊通勝，倪立俊

（麗珠集團(tuán)新北江制藥股份有限公司 511500）

多拉菌素由阿維鏈霉菌的bkdFGH基因缺失突變株發(fā)酵過程中添加環(huán)己羧酸生物合成，為阿維菌素第三代衍生物，是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，與阿維菌素相比，其在動(dòng)物體內(nèi)清除率較低、生物半衰期較長、生物利用率比較高，而且其注射劑的刺激性小，可進(jìn)行肌肉注射，給藥方便，持效期更長，一次給藥就可以殺死動(dòng)物體內(nèi)的線蟲和體外寄生蟲，不需要重復(fù)給藥，因此其在養(yǎng)豬業(yè)及寵物業(yè)上應(yīng)用的比較廣泛。

目前公開文獻(xiàn)中多拉菌素發(fā)酵技術(shù)不僅存在發(fā)酵產(chǎn)量低的問題，而且大多都還處于實(shí)驗(yàn)室階段，工業(yè)化進(jìn)程緩慢，因此多拉菌素急需要一種適用于工業(yè)化大生產(chǎn)和發(fā)酵產(chǎn)量高的技術(shù)。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本研究提供了一種新的多拉菌素的制備方法。多拉菌素主要存在于發(fā)酵后的菌絲體中，是阿維鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此影響其合成的因素很多，如碳源、氮源、溫度等。另外，發(fā)酵產(chǎn)生多拉菌素的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是加入前體物質(zhì)環(huán)己羧酸或其鹽，其補(bǔ)加量以及補(bǔ)加時(shí)間是工藝控制的重點(diǎn)。例如，環(huán)己羧酸或其鹽添加量少，阿維鏈霉菌的代謝活動(dòng)不會(huì)受到太大的影響，但是同時(shí)會(huì)因可轉(zhuǎn)化為多拉菌素的前體少導(dǎo)致多拉菌素的發(fā)酵產(chǎn)量低；而添加過量的環(huán)己羧酸或其鹽，會(huì)影響發(fā)酵培養(yǎng)基的物質(zhì)平衡，過多的環(huán)己羧酸或其鹽會(huì)抑制阿維鏈霉菌的代謝活動(dòng)，也會(huì)導(dǎo)致多拉菌素發(fā)酵產(chǎn)量低。

從公開文獻(xiàn)姜薇的碩士論文《多拉菌素的突變生物合成及發(fā)酵條件優(yōu)化》、吳婕的碩士論文《多拉菌素產(chǎn)生菌的誘變育種及培養(yǎng)條件的優(yōu)化》、 專利ZL201010568764.2、 專利ZL200710043687.7可以看到，現(xiàn)有技術(shù)的環(huán)己羧酸或其鹽在發(fā)酵過程中只添加一次，添加的方式為配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)直接加入，在發(fā)酵后24h或者48h加入，各文獻(xiàn)中添加量也可以相差十倍以上，并沒有統(tǒng)一的添加標(biāo)準(zhǔn)。

在開發(fā)多拉菌素發(fā)酵工藝過程時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)阿維鏈霉菌生長情況會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)一定的變化，定期的監(jiān)測阿維鏈霉菌的生長情況，意外的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)阿維鏈霉菌的生長情況，可以分2次加入環(huán)己羧酸或其鹽以降低環(huán)己羧酸或其鹽對(duì)菌種活力的影響；更進(jìn)一步的，我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程的前中期和后期，分2次加入環(huán)己羧酸或其鹽，可以有效的增加前體物質(zhì)環(huán)己羧酸或其鹽的投料總量，同時(shí)盡可能降低前體物質(zhì)環(huán)己羧酸或其鹽對(duì)菌種的抑制作用，從而增加多拉菌素的發(fā)酵產(chǎn)量；發(fā)酵過程中2次添加環(huán)己羧酸的時(shí)間需要根據(jù)長期監(jiān)測的阿維鏈霉菌生長情況確定，嚴(yán)格控制添加環(huán)己羧酸的時(shí)間可以有效的提高多拉菌素的發(fā)酵產(chǎn)量。

下面結(jié)合3個(gè)實(shí)驗(yàn)離子對(duì)本技術(shù)內(nèi)容作進(jìn)一步詳述，材料配方及工藝參數(shù)的選擇可因地制宜而對(duì)結(jié)果無實(shí)質(zhì)性的影響。實(shí)驗(yàn)所用菌株：菌種Streptomyces avermiti1is XJ-8-115，由國家糧食局科學(xué)研究院篩選保藏。發(fā)酵培養(yǎng)基及配比：玉米淀粉80g/L，棉籽餅粉15g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，消泡劑1.6g/L，脫脂大豆粉15g/L，五水磷酸三鎂2g/L，輕質(zhì)碳酸鈣7g/L，氯化鈉1g/L，PH7.0。

實(shí)驗(yàn)1

1.1 配制 350L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃～123℃滅菌 20min。接種量 10%，接種后以罐溫28.0℃±0.5℃、罐壓 0.04MPa、流量 25m 3/hr、轉(zhuǎn)速 80rpm 進(jìn)行培養(yǎng) 228h。

1.2 補(bǔ)料策略 ：分兩次補(bǔ)加前體環(huán)己甲酸鹽，第一次補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵40h加入，補(bǔ)加量為1.0g/L；第二次補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵 180h加入，補(bǔ)加量為 0.6g/L。

1.3 發(fā)酵中后期添加麥芽糊精作為補(bǔ)料糖，控制總糖在2.5%～4.5%；最后放罐單位773mg/L。 環(huán)己甲酸鹽為環(huán)己甲酸溶液中加入等物質(zhì)的量NaOH，并配制成20%濃度的環(huán)己甲酸鹽溶液。

實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3

2.1 培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)1相同，培養(yǎng)時(shí)間延長至312h。

2.2 發(fā)酵中后期添加麥芽糊精作為補(bǔ)料糖，控制總糖在2.5%～4.5%。

2.3 補(bǔ)料策略：實(shí)驗(yàn)1：分兩次補(bǔ)加前體環(huán)己甲酸鹽，第一次補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵40h加入，補(bǔ)加量為1.0g/L；第二次補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵180h加入，補(bǔ)加量為0.6g/L。

2.4 實(shí)驗(yàn)2：補(bǔ)加一次前體環(huán)己甲酸鹽，補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵 40h加入，補(bǔ)加量為 1.6g/L。

2.5 實(shí)驗(yàn)3：補(bǔ)加一次前體環(huán)己甲酸鹽，補(bǔ)加環(huán)己甲酸鹽在發(fā)酵180h加入，補(bǔ)加量為 1.6g/L。

表1 前體環(huán)己羧酸添加次數(shù)篩選結(jié)果

所以，從表1的前體環(huán)己羧酸添加次數(shù)篩選結(jié)果可以得出，實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3的平均發(fā)酵單位均顯著低于實(shí)驗(yàn)1的平均發(fā)酵單位，即說明補(bǔ)加兩次前體環(huán)己羧酸更加符合菌株的生長情況。補(bǔ)加一次前體環(huán)己羧酸，不論是在發(fā)酵的前中期還是在發(fā)酵的后期，多拉菌素的發(fā)酵單位不如補(bǔ)加兩次前體環(huán)己羧酸的發(fā)酵單位。