代謝組學在中藥復方研究中的應用＊

繆瀟瑤，肖炳坤，孫云波，王翠芳，楊建云，黃榮清＊＊

（1.軍事科學軍事醫學研究院輻射醫學研究所 北京 100850；2.廣州中醫藥大學 廣州 510006）

中藥復方集中體現了傳統中藥預防與治療疾病的優點和特點，是中醫臨床用藥的主要手段。建立符合中藥復方自身特點的研究方法來系統的揭示其科學內涵將有助于中藥復方的現代化發展和傳承。代謝組學通過測定生物體系在內在、外在因素作用下其代謝產物的變化或其隨時間的變化來研究該生物體代謝網絡的變化，它最大的特點是建立了整體觀來剖析生命現象本質，這與中醫整體觀理念十分契合[1,2]。代謝組學采用現代儀器分析結合化學計量學可進行系統性、整體性、客觀性的分析，為中藥復方研究提供了嶄新的研究思路[3]。本文總結了本課題組近幾年運用代謝組學技術開展的中藥復方相關研究工作，同時回顧了其他學者的研究成果，對代謝組學技術應用概況及研究成果進行總結與分析，并對其研究前景進行展望。

1 代謝組學概論

代謝組學是20世紀90年代繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學發展起來的一門新興學科，是系統生物學的重要組成部分[4]。代謝組是某一時刻生物體所有內源性代謝物的集合，反映了其整體狀況。代謝組學是在特定時間內系統的分析某一生物體或細胞內所有小分子內源性化合物（相對分子量＜1000）的差異性表達[5]。根據研究目的可以將代謝組學分為發現代謝組學和靶向代謝組學，發現代謝組學（非靶向代謝組學）主要分析對照組和模型組代謝譜差異表達，運用化學計量學方法尋找差異性代謝物并進行鑒定，解釋代謝物與生物代謝途徑或生理狀態之間的聯系[6]。靶向代謝組學一般通過分析大量天然和變異生物樣本，對已確證的差異表達代謝物進行定量驗證[7]。目前代謝組學常用的分析技術有核磁共振（NMR）和色譜-質譜聯用，如 NMR[8]、HPLC-NMR-MS[9]、HPLC-MS[10]、UPLCMS[11]、GC-MS[12]、SFC-MS[13]、CE-MS[14]、ICP-MS[15]、IMMS[16]，此外還有 FT-ICR/MS[17]、FTIR[18]。目前，代謝組學運用以上現代分析技術在疾病研究[19,20]（生物標志物的尋找、治療療效監控、診斷）、藥物研發[21,23]、安全性評價[24]、中醫藥[25,26]、農業[27,28]、營養學[29,30]、環境毒理學[31,32]、微生物[33,34]等領域得到了廣泛的應用。

2 代謝組學在中藥復方研究中的應用

2.1 中藥復方的安全性評價

中藥及其復方的安全性問題是其被廣泛應用、走向國際所面臨的主要障礙之一。代謝組學采用現代儀器分析結合化學計量學方法可以對正常和非正常的生物樣本快速分析，對毒性靶器官進行定位，追溯毒性效應的軌跡。早期國外采用代謝組學研究內容之一就是藥物安全性評價及相關的毒理研究[35,36]。代謝組學具有系統性、靈敏性、特異性、動態性等特點，將其應用到中藥研究領域中可以全面的、客觀的評價中藥復方的安全性。近年來，國內對中藥安全性評價的代謝組學的研究開展了大量的工作。本課題組沈淑潔[37]等采用基于液質聯用的代謝組學研究了金鈴子散對大鼠造成亞急性毒性損傷的機制，結果發現中、高劑量金鈴子散組大鼠中與類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸轉換、賴氨酸代謝、谷胱甘肽代謝及抗血酸代謝等五條代謝通路相關的44個代謝物含量發生了顯著性改變，進而對大鼠機體造成了明顯的肝腎毒性。

由于中藥復方是多味中藥配伍組成的，這使得中藥復方安全評價需要研究各味中藥[38]。劉妍如[39]等采用基于NMR的代謝組學研究了黃藥子致大鼠肝損傷的動態變化，通過分析0-72 h內的尿液發現三羧酸循環中的檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸的含量在給藥組大鼠中呈顯著下降的趨勢，而甘氨酸的含量呈顯著上升的趨勢。王小娟[40]等采用基于NMR的代謝組學對川楝子毒性的時效、量效關系以及3個極性部位的毒性進行了研究，結果顯示隨著劑量的加大與給藥時間的延長，機體在得分軌跡圖上代謝軌跡偏離對照組越多，與空白組比較，高劑量組中檸檬酸、琥珀酸、2-OG、牛磺酸、甜菜堿、甘氨酸水平下降，乳酸、TMAO、肌酸/肌酐水平升高；川楝子各極性部位組代謝物變化相似，乙酸乙酯部位導致轉氨酶顯著升高、體重顯著下降，是毒性集中部位。Tan[41]等基于LC-Q-TOF-MS的代謝組學研究了不同劑量的白附片對大鼠的毒性作用，結果表明不同劑量的白附片可以導致大鼠體內內源性代謝物產生不同程度的變化，其中甜菜堿濃度在不同劑量的白附片給藥組中呈上升趨勢，卵磷脂在不同劑量的白附片給藥組中呈下降趨勢，并且二者呈劑量依賴性，從而說明甜菜堿和卵磷脂可能是白附片產生毒性作用的敏感生物標志物；IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析結果顯示RhoA信號、膽堿代謝和自由基清除的擾動可能是白附片產生毒性作用的機制。Wang[42]等人采用基于LC-MS的代謝組學對不同劑量狼毒致大鼠毒性損傷進行研究，結果顯示18種氨基酸、有機酸、脂肪酸類的內源性化合物的含量在給藥組中產生了顯著的變化，并呈劑量依賴性；對代謝物富集后進行通路分析，結果顯示狼毒可能擾亂了大鼠體內的脂質代謝和氨基酸代謝，并結合組織病理學結果揭示了狼毒的肝毒性作用，為其致毒機制提供了研究基礎。

2.2 中藥復方的配伍規律研究

配伍是中藥復方的核心關系，也是中醫智慧的凝聚。然而“君臣佐使”、“升降沉浮”等配伍理論難以用現代科學語言全面詮釋清楚，所以中藥復方的配伍規律研究成為了中醫現代化亟需解決的重大問題之一。中藥復方發揮治療對應證候的效果絕不是單味藥物之間的簡單加和，而是取決于質與量的關系，不同的質與量的組合發揮的治療效果是不盡相同的。代謝組學具有高通量、高靈敏等優勢，可以客觀的、無歧視的反映機體內源性代謝物的代謝輪廓從而反映出其生理狀況，對于研究中藥復方中復雜的“量效關系”與“組效關系”是最有效的分析手段[43,44]。

近年來很多學者采用代謝組學研究中藥復方的配伍規律并取得了一定的成果。本課題組王小娟[40]等基于NMR的代謝組學研究了白芍配伍川楝子減毒作用，通過分析比較川楝子組與川白配伍組大鼠尿液代謝輪廓，發現與川楝子組相比，配伍組減少了尿液中甲酸、葡萄糖、檸檬酸、琥珀酸、2-OG、肌酸/肌酐、乳酸、谷氨酰胺、TMAO等代謝物的變化；從生化指標上看，配伍組與對照組相比轉氨酶升高但無統計學意義，少量肝細胞、腎小管上皮細胞變性。為白芍配伍川楝子減毒機制提供了參考依據。Wang[45]等運用基于UPLC/ESISYNAPT-HDMS代謝組學研究方法，探討了六味地黃丸其全方、三泄方（澤瀉、茯苓、丹皮）及三補方（熟地、山藥、山茱萸）對腎虛大鼠內源性化合物的影響，結果顯示三泄組幾乎沒有療效，三補組有療效但弱于全方組，為其配伍規律研究提供科學依據。Li[46]等采用基于UPLC-QTOF/MS的代謝組學研究了血虛大鼠在當歸、川芎和歸芎藥對干預下的血液和尿液代謝變化，結果發現與正常大鼠比較血虛大鼠中溶血性磷脂酰膽堿類、鞘胺醇、神經酰胺、植物鞘胺醇和甘油磷酸膽堿有上調趨勢，油酸、8,11,14-二十碳三稀酸和經孕稀醇酮有下調趨勢；以上代謝紊亂的內源性化合物在當歸、川芎、歸芎組大鼠中均向正常狀態調轉，但川芎藥對的療效要優于兩味單味藥。梁琦[47]等采用基于NMR的代謝組學研究了廣防己與黃芪配伍后緩解廣防己腎毒性的作用，在給予廣防己、廣防己配伍黃芪4周后測定大鼠尿液中的內源性代謝物，結果顯示廣防己組尿液中檸檬酸、2-酮戊二酸、葡萄糖、馬尿酸鹽、TMAO、肌酸、肌酐的水平發生了顯著的變化，而配伍組中這些化合物的水平變化呈不同程度的減小；同時腎組織病理檢查結果顯示配伍組的病變范圍及程度輕于廣防己組，為廣防已配伍黃芪緩解其腎毒性作用提供了病理形態及分子層面的解釋。

2.3 中藥復方的作用機制研究

中藥復方由多味中藥配伍組成，每味中藥含復雜的化學成分，這就決定了中藥復方具有多組分、多靶點、多途徑等特點。如何闡明中藥復方藥效物質基礎和作用機制是中藥復方現代化研究的又一關鍵問題。代謝組學屬于系統生物學研究方法，它把機體作為一個整體來研究，與中醫整體觀、辨證施治理念十分契合[48]。代謝組學從內、外因素對生物代謝網絡影響的角度出發，具有系統性和動態性，對中藥復方的整體療效的評價是十分有效的研究方法。李晶晶[49]等采用基于高效液相-質譜聯用的代謝組學技術，觀察半夏厚樸湯對抑郁大鼠尿液中代謝物的影響，結果顯示空白組、模型組與給藥組的代謝輪廓均有差異；相對于空白組，模型組中參與能量代謝的檸檬酸、乳酸、2-酮戊二酸含量減少以及馬尿酸、肌酐酸水平升高，而給藥組在一定程度上可以逆轉這種異常改變，表明半夏厚樸湯可能通過調節以上內源性化合物發揮抗抑郁作用，對其抗抑郁機制提供了分子層面的解釋。沈淑潔[50]等基于1H-NMR代謝組學技術研究了半夏厚樸湯鎮靜催眠作用，結果發現半夏厚樸湯可能通過調節巴比妥誘導睡眠模型大鼠中的谷氨酰胺、磷酸肌酸、2-酮戊二酸的含量，減輕腦內神經興奮性從而起到調節睡眠的作用。Shui[51]等運用基于LC-MS的代謝組學研究了一貫煎干預角叉菜膠致炎癥反應，生化分析結果顯示給藥組大鼠血清中的IL-1b、TNF-a、IL-6的水平明顯降低，代謝組學分析結果顯示血清中的膽堿、乙酰膽堿、組氨酸和花生四烯酸等含量顯著下調以及牛磺酸、色氨酸、馬尿酸和黃尿酸等含量顯著上調，推測一貫煎通過調節色氨酸代謝、脂質代謝、氧化應激、乙醛酸-二酸酸代謝及牛磺酸-亞牛磺酸代謝發揮抗炎作用機制。蔡小蓉[52]等采用GC-MS代謝組學方法研究了a-萘異硫氰酸酯致大鼠黃疸型肝損傷生物標志物，并探討了茵陳五苓散治療黃疸型肝損傷的作用機制，結果表明模型組大鼠血液中14個代謝物含量發生了顯著變化；與空白組比較，高劑量給藥組中琥珀酸、檸檬酸、亞油酸、甘油酸、肌醇的含量無顯著性差異；高劑量給藥組中絲氨酸、蘇氨酸、花生四烯酸雖未恢復正常水平，但與模型組呈顯著性差異；推測茵陳五苓散可能通過調節氧化應激、三羧酸循環及氨基酸代謝等途徑發揮干預大鼠黃疸型肝損傷作用。Tian[53]等采用基于GC-MS的代謝組學對健康自愿者與抑郁癥患者以及抑郁癥患者給予逍遙丸前后尿液中的差異性代謝物進行了定性、定量分析，結果顯示與健康者比較，給藥前抑郁癥患者尿液中丙氨酸、馬尿酸、檸檬酸的含量顯著上升，苯丙氨基酸、絡氨酸的含量顯著下降；而抑郁患者在給予逍遙丸6周后，其尿液中丙氨酸、馬尿酸、檸檬酸的含量均顯著下降，苯丙氨酸、絡氨酸的含量顯著上調，推測逍遙丸可以調節機體的神經遞質、氨基酸、能量代謝發揮治療抑郁作用。Song[54]等采用基于NMR的代謝組學研究了血府逐瘀湯治療高脂飲食致高血脂癥的作用，結果顯示血府逐瘀湯可以減少機體內的酮體和乙酰糖蛋白的累積，提高谷胱甘肽合成，同時還可以調節能量代謝、脂質代謝，為其發揮治療高血脂癥作用機制研究奠定了基礎。

3 展望

中藥復方是中華民族的瑰寶，如何用科學語言來闡明中醫理論和中藥復方的科學性是當前要致力解決的問題。代謝組學是新興的一門系統生物學學科，具有系統性、靈敏性、特異性和動態性等特點，是一種與中醫理論不謀而合的現代研究方法，它為中藥現代化研究提供了嶄新的思路。代謝組學應用到中藥復方領域中來可以評價其整體藥效，將有利于系統地深刻地揭示中藥復方的內涵。近年來，利用現代分析技術NMR、LC-MS、GC-MS等代謝組學技術已取得了一定的成果，但是代謝組學是處于發展的階段的新興學科，儀器分析技術、樣品處理方法、數據分析的手段等仍需要進一步完善。但是筆者相信在隨著各技術不斷地完善，代謝組學在中藥復方研究領域中會有更加廣闊的應用前景，也必將推動中藥復方現代化進程，使我們更加深刻地理解中藥復方的科學內涵，更好的傳承和發展中醫藥事業。

以基因、mRNA、蛋白質、代謝產物為研究對象的基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學同是系統生物學的重要組成部分。體內小分子內源性化合物是基因表達的最終產物，因此代謝組學可以獲得與機體病理狀態或藥物作用的直接相關代謝信息。但是要進一步驗證生物標志物、闡明疾病發生機制與藥物作用機理還需結合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學研究，通過對各個組學的數據進行整合，才能將數據轉化為知識。