β-乳球蛋白纖維化過程中的界面及乳化性質

黃 穎，高志明,2，吳彬嫻，林展拓，趙俊俊，方亞鵬,2,*

（1.湖北工業大學 菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068）

β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分[1]，約占乳清蛋白總量的50%。β-乳球蛋白分子質量約為18.4 kDa[2]，等電點為5.1～5.3，含有162 個氨基酸殘基[3]，具有良好的凝膠，起泡和乳化性能[4]。在一定條件下，蛋白質單體經過構象改變，β-折疊增多并重新排列而發生聚集[5-6]，這種聚集可以產生蛋白質納米纖維。蛋白質納米纖維是蛋白質在低pH值（例如pH 2.0～3.0）條件下進行熱處理得到的長直型自組裝產物，其直徑和長度尺寸分別在2～5 nm和200 nm～15 μm范圍內，是具有較大長徑比的形狀各向異性材料。Dietler等[7]通過原子力顯微鏡表征了蛋白質納米纖維的精細結構，認為蛋白質納米纖維最初形成“原纖維”即單股聚集體，然后經過螺旋纏繞逐步形成多股螺旋結構，形成成熟的納米纖維。蛋白質納米纖維具有許多特殊的物理化學特性以及生物特性，例如具有良好的表面活性和細胞穿透性[8-11]，可被用于藥物載體的構建以強化細胞吸收。同時因其良好的流變特性，可用作增稠劑和凝膠填充物[12-13]。蛋白質纖維聚集體具有特殊的表面活性。Mezzenga等[14]比較了天然β-乳球蛋白及其納米纖維在油水和汽水界面的吸附和剪切流變性質，發現熱處理蛋白形成的纖維聚集體可以吸附于油水界面，其界面剪切模量明顯高于天然蛋白質。該研究還發現，未轉化成纖維聚集體的多肽的存在有可能會提高蛋白界面吸附和乳化性質。該團隊還發現，改變水相的pH值和離子強度，蛋白質纖維聚集體在油水界面具有不同的排列模式，并產生不同的界面流變特性[15-16]。Gao Zhiming等[17]也曾對蛋白質納米纖維的乳化活性做過報道。

蛋白質纖維化轉變過程較長（約4～10 h），其形成過程較為復雜。在纖維生成的不同階段，其產物的組成、結構、尺寸以及界面性質及乳化活性均不同。本實驗主要針對β-乳球蛋白在纖維形成的不同階段，研究其產物的界面及乳化活性，為其在食品工業中的合理利用提供理論依據，特別是富含蛋白質的飲料[18-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用大豆油 市售；β-乳球蛋白（蛋白質干基質量分數97%，其中β-乳球蛋白占95.9%） 美國Davisco食品公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、硅鎂型吸附劑/氟羅里硅土（Florisil分子篩，60～100 目） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Direct Q3型超純水機 美國Merck Millipore公司；FE-20 FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多國際股份有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；Multifuge高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡 日本電子Jeol公司；TRACKER界面流變儀 法國Teclis界面技術有限公司；PT-MR 2100型高速剪切乳化機 瑞士Kinematica公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質納米纖維的制備

將β-乳球蛋白分散于去離子水中（2%），室溫攪拌2 h，使其充分水化。調節蛋白質分散液pH 2.0，置于80 ℃水浴鍋加熱20 h，此過程持續磁力攪拌，每隔2 h定時取樣，取出后立即浸沒在冰水混合物中，冷卻20 min，隨后保存于冰箱備用。

1.3.2 蛋白質納米纖維形成動力學表征

將12.0 mg ThT溶解于10 mL去離子水中，充分溶解后，用0.22 μm水相濾膜過濾，于4 ℃冰箱中避光保存。在制備β-乳球蛋白納米纖維的過程中，取不同加熱時間樣品2.98 mL，加入20 μL ThT儲藏液，均勻混合，反應1 min后進行測量。激發和發射波長分別為450 nm和482 nm，激發和發射狹縫均為5 nm，電壓為400 mV。

1.3.3 透射電子顯微鏡

將β-乳球蛋白纖維分散液用pH 2.0的去離子水稀釋到質量分數為0.05%，在水浴超聲清洗裝置中以功率50%超聲處理10 min，促進樣品分散。接著，用移液槍吸取10 μL樣品滴至銅網上，自然晾干，隨后用毛細管吸取2 g/100 mL的磷鎢酸（水浴超聲30 min，100%功率，且用0.22 μm水相濾膜過濾）滴至樣品表層，再次晾干后進行電鏡觀察。

1.3.4 界面吸附和界面流變行為分析

分別通過分析蛋白質纖維聚集體在界面吸附過程中的界面張力變化和膨脹黏彈模量的變化分析其界面吸附行為和界面流變行為。取不同階段所形成的混合分散體系稀釋至質量分數0.01%并調pH 3.5后進行界面分析，選取界面流變儀的懸滴模式檢測樣品在油-水界面上的吸附情況。量取5 mL混合分散液于樣品槽中，將U形樣品針浸入水相中，并通過馬達控制形成10 μL的油滴。該實驗在室溫條件下進行，測定時間持續12 000 s，測試頻率0.05 Hz，振幅10%。在檢測過程中，整個檢測系統應保持平衡，避免外界振動干擾測量。

由于食用大豆油中含有的少量小分子表面活性成分容易對測定結果產生干擾，因此使用前需要進行純化。參考Gaonkar等[20]的方法，在100 mL食用大豆油中加入3 g Florisil分子篩吸附劑，隨后攪拌0.5 h，靜置5 min，5 000 r/min離心20 min，再加入新的吸附劑，重復上述操作3 次，收集純化后的大豆油，利用界面流變儀測定去離子水的界面張力，直到其界面張力在30 min內下降不超過0.5 mN/m即可滿足要求。純化后大豆油的密度為 0.914 2 g/cm3，去離子水與油相的界面張力為（27±0.1）mN/m。

1.3.5 乳液制備及表征

乳液的制備：將一定量的β-乳球蛋白纖維化產物用去離子水稀釋至一定濃度，并用1 mol/L NaOH溶液調pH值至3.5，加入大豆油，配成蛋白總質量分數為0.5%，油量體積分數為10%的混合液，采用高速剪切進行乳化20 000 r/min離心2 min，乳液中添加0.4 g/L的疊氮鈉防菌。

粒徑分析：以去離子水為分散介質，采用Mastersizer 2000激光粒度儀測定乳液粒徑分布及平均粒徑。測定加樣前先將乳液輕微振蕩搖勻，再逐滴加至分散介質中，直到信號滿足測試要求。分散相和連續相的折光指數分別采用1.475和1.33，遮光度為10%～20%，樣品的吸收率為0.1%，泵轉速為2 000 r/min。每個樣品平行測量3 次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 β-乳球蛋白納米纖維形成動力學

圖1 加熱不同時間的β-乳球蛋白納米纖維的ThT熒光強度Fig. 1 Thioflavin T fluorescence intensity of β-lactoglobulin fibrils at different heating times

ThT熒光染色法是檢測蛋白質纖維化的典型方法。ThT通過與蛋白質纖維中β-折疊結構的特異性結合而具有特定的熒光行為。該方法可以檢測β-折疊結構的變化從而獲得纖維化程度的信息，即形成的蛋白質纖維的數量。ThT熒光強度越強，意味著形成的蛋白質纖維越多[21-23]。從圖1可以看出，熒光強度隨著加熱時間延長逐漸增加。在熱處理的前4 h內熒光強度的增加較為緩慢，隨后則快速增加。大約10 h后，曲線出現平臺區，熒光強度值保持相對穩定，意味著蛋白質纖維化轉變已經完成。本實驗觀察到的現象與其他蛋白質相關現象類似[18,24]。

2.2 β-乳球蛋白纖維聚集體形成過程中的形貌變化

如圖2所示，在開始階段（圖2A），β-乳球蛋白呈現出均勻球狀，粒徑約為30～40 nm，分散良好。加熱0.5 h后（圖2B）可觀察到球狀蛋白粒徑開始減小，而分布更加密集，可能由于蛋白質的水解導致[25-26]。直到加熱2 h后（圖2D），開始出現明顯的蛋白質納米纖維，但纖維數量較少。進一步加熱會導致纖維數量增加，直徑變粗（圖2E、F）。Mezzenga等[27]研究了纖維的形成機理及過程，發現蛋白質分子在反應初始階段發生水解，然后部分以β-折疊結構為主的片段在靜電排斥力和疏水相互作用的平衡下進行有序聚集，即自組裝作用，形成纖維狀聚集物。一旦纖維開始形成，其生長的進程快且雙向進行，最后形成具有長直結構的蛋白質纖維。從圖2可以得出，在蛋白質纖維化轉變的不同階段，其產物的組成、形貌是不同的，意味著其界面性質的差異。

圖2 加熱不同時間形成的β-乳球蛋白納米纖維的透射電子顯微鏡圖Fig. 2 TEM of β-lactoglobulin fibrils heated for different times

2.3 纖維化過程中β-乳球蛋白界面性質的變化

圖3 纖維化過程中β-乳球蛋白在油水界面的吸附動力學過程（A）及其飽和界面張力（B）的變化Fig. 3 Changes in adsorption kinetics (A) and saturated surface pressures (B) of β-lactoglobulin dispersions during fibrillation

乳液的形成及穩定性決定于界面物質的吸附行為和界面膜的黏彈模量[28-32]。采用懸滴法對β-乳球蛋白纖維化轉變過程中不同階段產物的界面吸附動力學過程和界面膜的黏彈模量進行研究。圖3A為各階段產物在油-水界面的界面張力隨時間的變化。可以觀察到，所有樣品的界面張力隨吸附時間逐漸上升，意味著不同階段產物均具有界面吸附行為。一段時間后界面張力上升速度趨于平緩，表明物質在界面上的吸附逐漸達到飽和。從圖3B可以發現，纖維化轉變不同階段的產物，其平衡界面張力存在區別。在開始階段，飽和界面張力隨蛋白加熱時間的延長而升高，當加熱時間超過2 h后，飽和界面張力的變化不再明顯。綜合上述分析可以看出，在熱處理的初始階段，蛋白質發生了水解，這一現象使得蛋白質分子質量變小，而擴散速度增加，因而相對未水解的蛋白能達到更高的飽和界面張力。盡管過度水解會導致蛋白質界面活性的破壞，但后期隨著納米纖維的形成，混合體系的整體界面活性仍然能保持較高水平。

圖4 纖維化過程中β-乳球蛋白在油/水界面的擴張流變學特性Fig. 4 Changes in interfacial dilatational rheological properties of dispersions during fibrillation

如圖4A所示，隨著蛋白不斷吸附到油-水界面上（界面張力的增加），樣品的黏彈模量也不斷增加，說明不同纖維化階段的產物在油/水界面存在明顯相互作用，使得界面層具有較強的黏彈性。同時隨著纖維化轉變的進行（加熱時間的延長），其界面黏彈模量逐漸升高，說明纖維化轉變有利于界面吸附層的黏彈性的提高。如圖4B所示，隨著纖維化轉變的進行，其飽和模量不斷升高，但在不同階段，其變化幅度不同。即在纖維化的初始階段上升較快，而后期則上升不明顯，這表示纖維化轉變的完成，體系中纖維的數量增加不再明顯，體系的界面黏彈模量的變化趨于平緩。蛋白質納米纖維屬于形狀各向異性材料，其在油/水界面上的相互作用不同于一般的球形顆粒或柔性高分子，具有更強的相互作用，因而能產生更高的界面黏彈性[33-37]。食品油/水界面或氣/水界面的穩定依賴于界面膜的強度，即黏彈模量[38]。目前食品行業大多數采用的吐溫、蔗糖酯等小分子表面活性劑所形成的界面膜通常較弱，在食品儲藏過程中容易使界面失穩，從而導致食品結構的破壞（如奶油的乳析、植脂末的滲油等）。蛋白質纖維聚集體所表現出的高界面強度則有助于上述問題的解決。

2.4 纖維化過程對β-乳球蛋白乳化性的影響

圖5 纖維化轉變過程中β-乳球蛋白納米纖維穩定的乳液外觀（A）、平均粒徑（B）和常溫貯藏時粒徑（C）的變化Fig. 5 Appearance (A), average droplet size (B) and storage stability (C)of emulsions stabilized by β-lactoglobulin dispersions during fibrillation

從圖5A可以看出，纖維化的各個階段的產物均能形成較為穩定的油/水乳液，并且隨著纖維化程度提高，乳液中乳化層的厚度增加，意味著纖維化產物的乳化能力的提高。通過乳液的平均粒徑（圖5B）可以看出，乳液的粒徑隨著纖維化程度的提高而逐漸減小，直至纖維化轉變2 h后，其產物形成的乳液粒徑趨于穩定，說明其乳化能力的變化不再明顯，與圖5A圖現象一致。如圖5C所示，隨著儲藏時間的延長，乳液的粒徑均有所上升，這是由于乳液在儲藏過程中乳滴之間發生了一定程度的絮凝或聚集。絮凝主要由于乳滴之間的靜電排斥力所致，而聚集則由于乳滴表面的界面強度不足所致。比較不同樣品在30 d儲藏過程中的粒徑變化發現，未轉化的蛋白乳液平均粒徑增加了1.907 μm，而纖維化0.5～12 h的蛋白，其乳液的平均粒徑分別增加了0.63 μm（0.5 h），1.08 μm（1 h），1.09 μm（2 h），3.00 μm（5 h），2.80 μm（7 h）和3.20 μm（12 h）。由此可見，纖維化0.5 h的乳液相對最為穩定，未經纖維化轉變或過長時間的纖維化轉變均不利于乳液的穩定性。纖維化轉變后，柔性蛋白分子轉變為具有一定剛性的纖維聚集體，該聚集體相對于蛋白分子具有更高的界面吸附能，從而提高了乳液的穩定性。而長時間的纖維化所導致的乳液穩定性下降，可能由于連續相中的纖維產生的耗散性絮凝所導致[17]。在實際應用中，乳化能力和乳化穩定性需要同時考慮。較高的乳化能力有助于形成粒徑較小的乳滴，而乳化穩定性有助于乳液保持長期的穩定性。綜合比較，纖維化2 h的蛋白質較適宜于在食品乳化中的應用。

3 結 論

本實驗對β-乳球蛋白在纖維化轉變不同階段的產物進行了表征，并對其界面及乳化行為進行了分析研究。在纖維化轉變初期，蛋白質發生水解，2 h后開始形成少量纖維。隨時間延長纖維數量則開始增加，直徑變粗。通過對界面吸附行為和界面流變性分析可知，β-乳球蛋白的纖維化轉變可有效提高其界面活性，且增強了界面上蛋白分子間的相互作用。通過乳化實驗，發現隨著纖維化轉變過程的延長，其產物的乳化能力逐漸提高，但乳化穩定性在開始階段有所提高，后期逐漸下降。綜合比較，纖維化2 h的產物最適宜用于食品的乳化。

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