響應面試驗優(yōu)化酶解法制備海洋微藻微擬球藻抗氧化肽工藝

呂小京，操德群,2，徐年軍,2,*

（1.寧波大學海洋學院，浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211）

自從Harman[1]提出自由基理論以來，人們認識到食物氧化變質(zhì)及人體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)生的自由基與人的衰老和很多疾病有關。自由基會對細胞核組織造成嚴重氧化損傷，加速人體衰老，也會誘發(fā)動脈硬化、老年癡呆癥、癌癥等疾病[2]。抗氧化劑具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的功能，可用于含脂肪食品的抗氧化及保健食品、化妝品的開發(fā)，因此抗氧化劑近些年在國內(nèi)外發(fā)展很快[3-4]。目前使用的多為化學合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯等，其本身具有毒副作用，所以各國政府對其添加量進行了嚴格控制[5]。生物體由于處于不同的生態(tài)環(huán)境，以及自然衰老等原因，體內(nèi)會產(chǎn)生很多自由基，如羥自由基、氧自由基等。生物體在長期的進化過程中，產(chǎn)生了多種抗逆機制，為了提高自身的抗逆性，生物體在逆境條件下應激性產(chǎn)生抗氧化肽類生物活性物質(zhì)。于是人們把目光逐步轉(zhuǎn)向從各種動植物組織中提取天然抗氧化劑。國內(nèi)外研究人員已從大米[6]、小麥[7]、玉米[8]、鷹嘴豆[9]、鴨肉[10]、雞蛋清[11]、草魚[12]、貽貝[13]、輪蟲[14]、螺旋藻[15]等動植物來源的蛋白質(zhì)中提取出了具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)。天然抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性強、易被人體吸收等特點，作為食品和機體的抗氧化劑，是近年來熱門的研究課題。

微擬球藻（Nannochloropsis）是一種海洋來源的餌料微藻，目前已經(jīng)被批準為新資源食品。微擬球藻生長周期短，營養(yǎng)價值高，并且可以實現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖，具有很大的開發(fā)潛力和商業(yè)化應用前景[16]。微擬球藻含有豐富的二十碳五稀酸、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值[17]，在美國、智利等國家倍受歡迎。目前，該藻種主要應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、保健食品、生物制藥、化妝品和生物柴油等領域[18]，對微擬球藻中生物活性物質(zhì)的研究還很少。本研究以微擬球藻為原料制備微擬球藻蛋白，通過酶解法制備微擬球藻抗氧化肽，以水解度及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性為評價指標，經(jīng)單因素試驗和響應面法分析確定了最佳酶解工藝條件，以期為微擬球藻抗氧化肽的開發(fā)及綜合利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微擬球藻（Nannochloropsis sp.）藻粉 煙臺海融生物技術有限公司。

胃蛋白酶、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、透析袋（截留分子質(zhì)量為3 500 Da） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、2-巰基乙醇、L-還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，GSH）、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-1C-80冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Sorvall ST 16R冷凍離心機 賽默飛世爾科技公司；SpectraMax 190全波段酶標儀 美國Molecular Devices公司；Vortex-2旋渦混合器 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；BSA224S電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；DHG-9070A（S）電熱恒溫鼓風干燥箱 寧波江南儀器廠；SevenEasy pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微擬球藻蛋白的制備

微擬球藻藻粉→超純水（固液比1∶10）→反復凍融→合并上層提取液→低溫離心（8 ℃，16 000×g，10 min）→上清液→減壓抽濾（0.45 μm水系濾膜）→濾液→鹽析（50%飽和度硫酸銨溶液）→低溫離心（8 ℃，10 000×g，10 min）→分別收集沉淀物和上清液→上清液進行二次鹽析（80%飽和度硫酸銨溶液）→低溫離心（8 ℃，10 000×g，10 min）→合并沉淀物→少量超純水溶解→透析（截留分子質(zhì)量為3.5 kDa，4 ℃，36 h）→冷凍干燥→微擬球藻蛋白（于-40 ℃棕色樣品瓶避光保存）。

1.3.2 蛋白質(zhì)量濃度標準曲線及可溶性蛋白含量測定

蛋白質(zhì)量濃度標準曲線的繪制采用考馬斯亮藍法，以BSA作為標準物，用考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)量濃度，測定波長為595 nm，以吸光度對蛋白質(zhì)量濃度繪制標準曲線[19]。根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度標準曲線即可求出微擬球藻蛋白溶液中可溶性蛋白含量。

1.3.3 酶解實驗

選用胃蛋白酶做酶解實驗。將微擬球藻蛋白用一定pH值的1.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，配制成一定質(zhì)量濃度的微擬球藻蛋白溶液，然后按一定比例加入蛋白酶，用旋渦混合器混勻，置于水浴鍋中在恒溫條件下進行酶解實驗。酶解8 h后，將酶解物于95 ℃水浴15 min滅酶活，室溫下冷卻后冰浴30 min，然后低溫離心（4 ℃，16 000×g，10 min），上清液過0.45 μm水系過濾器，取100 μL用于測定水解度，剩余溶液冷凍干燥得到微擬球藻蛋白酶解物，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 水解度的測定

水解度參照Vasquezvillanueva等[20]的OPA法進行測定。在96 孔酶標板中分別加入2.5 μL酶解液和100 μL OPA混合液，25 ℃孵化8 min，然后用酶標儀在340 nm波長下測定吸光度。用GSH（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL，用pH 7.0、1.0 mmol/L PBS配制）作為標準品繪制多肽含量的標準曲線，求出樣品中的多肽含量，蛋白含量用考馬斯亮藍法測定。水解度計算如式（1）所示：

1.3.5 DPPH自由基清除活性的測定

DPPH自由基清除率的測定參照Li Ke等[21]的方法并修改。將冷凍干燥后的酶解物（溶解于pH 7.0、1.0 mmol/L PBS）配制成2.0 mg/mL的樣品溶液，同時將DPPH溶解于無水乙醇中配制成0.16 mmol/L的DPPH溶液。在96 孔酶標板中加入100 μL樣品溶液和100 μL DPPH溶液，25 ℃避光反應30 min后，于517 nm波長處測定吸光度。同時以100 μL樣品溶液和100 μL無水乙醇混合后的吸光度為對照組；以100 μL 1.0 mmol/L PBS和100 μL DPPH溶液混合后的吸光度為空白組。DPPH自由基清除率計算如式（2）所示：

式中：Ai為樣品組溶液的吸光度；Aj為對照組溶液的吸光度；A0為空白組溶液的吸光度。

1.3.6 單因素試驗設計

酶解步驟如1.3.3節(jié)，分別對酶底比（質(zhì)量百分比1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%）、底物質(zhì)量濃度（0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mg/mL）、酶解溫度（27、32、37、42、47、52 ℃）、pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5）進行單因素試驗，考察各因素對酶解產(chǎn)物水解度及DPPH自由基清除活性的影響。

1.3.7 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，固定酶底比6.0%、酶解時間8 h，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以底物質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH值這3 個因素為自變量，DPPH自由基清除率為響應值，采用軟件Design-Expert V8.0.6設計三因素三水平的響應面分析試驗，確定微擬球藻蛋白酶解最佳工藝條件，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶底比對酶解物水解度及抗氧化活性的影響

在底物質(zhì)量濃度20.0 mg/mL、酶解溫度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的條件下，由圖1可知，隨著酶底比的增加，蛋白水解度逐漸增加，說明酶質(zhì)量分數(shù)的增加可以增加底物與酶的接觸機率，從而加速酶解反應進程，水解度增大[22]。當酶底比達到5%時，蛋白水解度達到最大，繼續(xù)增加酶底比反而使水解度略有下降，可能是因為隨著產(chǎn)物濃度的提高，產(chǎn)物與酶形成復合物，阻礙了底物與酶的結合，從而減緩了水解進程，使水解度緩慢減小。觀察酶解產(chǎn)物的抗氧化活性可以發(fā)現(xiàn)，不同酶底比對于酶解物的抗氧化活性影響不大，只在酶底比為6%時酶解物的DPPH自由基清除率略有增加。綜合考慮水解度和抗氧化活性，選擇最適酶底比為6%。

圖1 酶底比對酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 1 Effects of enzyme-to-substrate ratio on DH and antioxidant activity of hydrolysates

2.1.2 底物質(zhì)量濃度對酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 2 Effects of substrate concentrations on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、酶解溫度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的條件下，如圖2所示，水解度隨底物質(zhì)量濃度的增加而增加，說明增加底物質(zhì)量濃度能增加底物與酶的接觸幾率，從而加速酶解反應進程[23]。本實驗中酶解物的抗氧化活性未隨底物質(zhì)量濃度和水解度的增加而增加，而是呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這可能是由于過度酶解使一些活性多肽進一步被水解成小分子質(zhì)量的短肽，而這些短肽不具有或有較弱的抗氧化活性[24]。因此為了得到抗氧化活性較強的酶解產(chǎn)物，必須嚴格控制蛋白的酶解程度。由圖2可知，底物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL和3.0 mg/mL時，酶解物的DPPH自由基清除率差異不大，考慮到底物質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時酶解物的水解度過低，且反應體系所需溶劑體積過大，故選擇3.0 mg/mL為適宜底物質(zhì)量濃度。

2.1.3 酶解溫度對酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖3 酶解溫度對酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、pH 2.0、酶解8 h的條件下，由圖3可知，當酶解溫度小于47 ℃時，水解度逐漸增加，酶解溫度超過47 ℃后水解度明顯下降。這是因為一方面升高溫度可使反應體系內(nèi)的物質(zhì)運動加快，從而提高底物與酶的接觸幾率，加速反應進程；另一方面，過高的溫度使維持酶分子結構的次級鍵斷裂，導致酶活性降低，延緩了酶解進程，水解度下降[25]。觀察酶解產(chǎn)物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，與其他溫度相比，溫度為42 ℃和47 ℃時的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率相對較低，結合水解度變化曲線分析，造成這一現(xiàn)象的原因是在這兩個溫度條件下，酶解產(chǎn)物的水解度較大，過度的水解造成抗氧化肽的結構被破壞，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性降低。其他溫度條件下，酶解物的水解度都在54.94%～56.98%之間，其抗氧化活性也相差不多，說明在一定的水解度下，酶解產(chǎn)物具有合適且穩(wěn)定的肽段長度和氨基酸比例，從而具有良好的抗氧化活性。酶解溫度為37 ℃時，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最大，且胃蛋白酶的最適溫度為37 ℃，故選擇37 ℃為最適酶解溫度。

2.1.4 pH值對酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖4 pH值對酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 4 Effect of pH value on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、酶解溫度37 ℃、酶解8 h的條件下，如圖4所示，酶解產(chǎn)物的水解度隨pH值的變化呈現(xiàn)不規(guī)則波動，而酶解物的抗氧化活性則呈現(xiàn)先增后減的趨勢。這是因為反應體系pH值的變化會直接影響酶分子及底物分子的解離狀態(tài)、酶蛋白活性中心的構象，進而影響酶與底物的結合、酶穩(wěn)定性及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，最終影響酶解產(chǎn)物的性質(zhì)[26-27]。從圖4可以看出，pH值小于2.0時酶解產(chǎn)物的抗氧化活性較強，pH值大于2.0后酶解產(chǎn)物的抗氧化活性急劇下降，可能是由于胃蛋白酶的最適pH 1.0～2.0，在這一范圍內(nèi)，胃蛋白酶的活性高，酶解效果好。pH 1.5時，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到最大，所以確定最佳pH值為1.5。

2.2 酶解工藝響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結果

綜合單因素試驗結果，固定酶底比6.0%、酶解時間8 h，以底物質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH值這3 個因素為自變量，DPPH自由基清除率為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理進行響應面試驗，試驗設計方案與結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計方案與結果Table 2 Experimental design with response variable for response surface analysis

2.2.2 模型的建立與方差分析

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

利用軟件Design-Expert V8.0.6進行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

Y=39.58+7.97A+0.41B+0.70C-1.88AB-6.03AC-0.80BC-0.95A2+4.44B2-8.00C2

回歸方程的方差分析結果見表3。回歸模型的決定系數(shù)（R2）為0.948 3，說明DPPH自由基清除率的實測值與預測值擬合較好；調(diào)整決定系數(shù)（）為0.855 3，表明該模型能解釋85.53%響應值變化。該模型的P值小于0.01，表明該回歸模型極顯著；模型失擬項P值為0.963 5，該模型失擬項不顯著，說明方程擬合度高，可用此模型預測底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和pH值對DPPH自由基清除活性的影響。模型中一次項A和二次項C2影響極顯著，交互項AC和二次項B2影響顯著，可判斷出各因素對響應值的影響是一個復雜的過程，并非簡單的線性關系。通過方差分析表中各因素的F值可評價各因素對試驗指標的影響，F(xiàn)值越大，影響越顯著。由表3可知，各因素對微擬球藻蛋白抗氧化活性的影響順序為底物質(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度。

2.2.3 響應面分析

分別固定各因素中的1 個因素在0水平，得其余2 個因素的交互作用對抗氧化活性影響的三維響應面圖和等高線圖，可以直觀地反映各因素的交互作用對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響[28]，如圖5所示。等高線是響應面中水平方向的投影，等高線的形狀可反映出交互作用是否顯著，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著[29]。圖5a、b等高線表現(xiàn)為橢圓形，說明底物質(zhì)量濃度和酶解溫度、底物質(zhì)量濃度和pH值的兩因素交互作用明顯。如果一個響應面坡度相對平緩，表明處理條件的變化對響應值的影響不大，相反，如果一個響應面坡度非常陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[30]。圖5a、b顯示，沿A軸方向的響應面的坡度明顯比較陡峭，說明底物質(zhì)量濃度的變化對DPPH自由基清除率的影響比另外兩個因素對其的影響大。圖5c顯示，B軸方向的響應面坡度比C軸更為平緩，說明pH值的變化對響應值的影響比溫度對響應值的影響大。該結論與方差分析結果一致：各因素對微擬球藻蛋白抗氧化活性的影響順序為底物質(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度。

圖5 雙因素交互影響DPPH自由基清除活性的響應面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on DPPH radical scavenging activity

2.2.4 最佳酶解條件的確定及驗證

分析得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、酶解溫度32 ℃、pH 1.36，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率的預測值為53.16%。按照該工藝條件進行3 次重復實驗，測得最佳酶解條件下酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為（51.85±1.20）%，與預測值接近，其相對誤差為2.5%，說明通過響應面法優(yōu)化得到的回歸模型方程及最佳條件可靠。

3 結 論

本研究在單因素試驗的基礎上，利用響應面法建立酶解法制備微擬球藻抗氧化肽工藝的二次多項回歸方程，通過方差分析，該模型顯著，所得回歸方程擬合度高。最終確定最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、酶解溫度32 ℃、pH 1.36、酶底比6%。在此酶解條件下DPPH自由基清除率達51.85%，與預測值接近，說明通過響應面法建立的回歸模型方程準確可靠，這為進一步分離純化微擬球藻抗氧化肽提供了參考。

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