不同生長年限鐵皮石斛多糖含量與特性分析

秦子芳，譚曉妍，寧慧娟，胡 靜，苗雨欣，張秀清*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

鐵皮石斛（Dendrobium oきcinale）是蘭科石斛屬類植物，全球共有約1 500 種，廣泛分布在亞洲、歐洲、澳洲等地區[1]。在我國，其主要分布在廣西、福建、安徽、四川、浙江、云南和貴州等西南和華南地區[2]。石斛是非常受大眾喜愛的傳統中藥材之一[3]，在《神農本草經》中早有記載，被列為上品[4]，具有美容養胃、滋陰清熱、提高人體免疫力、抗氧化和延緩衰老等功效，用于治療不明發熱、口干舌燥、目暗不明、陰虛火旺、陰傷津虧、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、筋骨無力等病癥[5-9]，藥用歷史悠久。

藥理學研究表明，多糖在鐵皮石斛的活性成分中含量最高，是其主要活性物質，具有多種藥理活性[10-14]。近年來，鐵皮石斛多糖的研究越來越深入。有研究表明多糖活性與多糖的單糖組成具有重要的關系，《藥典》[15]對鐵皮石斛多糖中甘露糖和葡萄糖的物質的量比例作出了相關規定，同時，有研究表明，多糖中的甘露糖與葡萄糖的比例越高，其抗癌活性越好，因為在人體的巨噬細胞中有對這兩種糖有識別作用的多糖受體[16]。楊虹等[17]研究表明鐵皮石斛多糖中主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖，何鐵光等[18]從鐵皮石斛原球莖中分離得到的多糖中甘露糖和葡萄糖物質的量比為7.015∶1，Xia Linjing等[19]分離得到2 個多糖D1和D2，主要單糖組成是半乳糖和葡萄糖，含有微量的阿拉伯糖。關于鐵皮石斛多糖抗氧化活性的研究，Fan Yijun等[20]的研究表明，鐵皮石斛組織培養物具有較強的清除活性氧的能力，尤其是對羥自由基的清除，通過顯著提高超氧化物歧化酶水平，降低過氧化脂質作用，最終清除體內自由基。查學強等[21]的研究表明，鐵皮石斛莖中多糖對超氧離子自由基和羥自由基有較強的清除能力。

目前市場上流通的鐵皮石斛一般種植年限為2～4 a，2010版《藥典》中雖然對采收季節做出了具體規定，即每年11月至翌年3月，但是關于種植年限問題卻沒有統一的規定。實驗分析不同種植年限鐵皮石斛中多糖的含量、單糖組成和多糖分子質量的變化情況，并且對其抗氧化活性進行分析，旨在為進一步深入探究鐵皮石斛多糖的積累規律和藥理活性奠定基礎，為鐵皮石斛的采收和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1～5 a生鐵皮石斛樣品由江西龍虎山道地藥材自有基地提供，樣品經80 ℃烘干，粉碎，過60 目篩備用。

葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、核糖標準品（純度≥98%） 北京化學試劑公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TG16-WS高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；TM-1901型雙光束紫外-可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RE52CS旋轉蒸發儀 上海亞絨生化儀器廠；TYS-100高速多功能粉碎機 浙江省永康市紅太陽機電有限公司；BS200S電子天平 北京賽多利斯天平公司；DHG-9240A鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；KQ3200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；1200高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；DZKW-C型恒溫水浴鍋 北京中科星宇商貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛多糖的制備及測定

稱取0.500 g粉碎過20 目的鐵皮石斛樣品，置于50 mL離心管中，用5 mL去離子水浸潤樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，使用渦旋振蕩器振搖混勻，置超聲提取器中（150 W）提取30 min。提取結束后，于6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用去離子水將不溶物轉移入圓底燒瓶，加入50 mL去離子水，于沸水浴中提取2 h。冷卻至室溫，離心、抽濾后取上清液，按體積比1∶4的比例加入無水乙醇，4 ℃保存過夜，于6 000 r/min離心10 min，取沉淀烘干即為鐵皮石斛多糖樣品。

標準曲線繪制方法：準確稱取105 ℃干燥至質量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，取出1 mL該溶液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。準確吸取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于試管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min后，搖勻，待反應液完全冷卻后，于波長490 nm條件下測定其吸光度，以蒸餾水為空白實驗[22]。以葡萄糖含量（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。取一定量多糖樣品加蒸餾水復溶，測定樣品多糖的吸光度，按照標準曲線計算多糖含量。

1.3.2 多糖分子質量的測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法測定多糖分子質量。將樣品及系列標準多糖（不同分子質量的葡聚糖180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa）分別流經Agilent PL aquageL-OH MIXED-M色譜柱，流動相為0.1 mol/L硝酸鈉溶液，流速1.000 mL/min，示差折光檢測器[23]。以保留時間（x）為橫坐標，標準品的相對分子質量對數（y）為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線及Agilent GPC軟件計算多糖分子質量。

1.3.3 單糖組成分析

取鐵皮石斛多糖樣品10 mg置于5 mL消解管中，加2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，擰緊管口，105 ℃水解3 h，烘干溶液中的三氟乙酸，用少量無水甲醇洗滌使殘留的三氟乙酸揮發。

加入3 mL蒸餾水復溶，取水解液1 mL置于10 mL離心管，依次加入0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液600 μL，0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）甲醇溶液600 μL，渦旋混勻，70 ℃水浴反應2 h，冷卻至室溫。加入0.3 mol/L的HCl溶液600 μL中和反應體系，并加入1 mL的氯仿溶液萃取，棄去下層有機相，重復操作5 次，去除體系中多余的PMP，取上層水相過0.22 μm的濾膜，進行液相色譜分析。以標準單糖的糖醇全乙酰化衍生物（制備方法同多糖樣品，但無需進行三氟乙酸水解）作對照[24-25]。

色譜條件：1200高效液相色譜儀，色譜柱Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），G1314B可變波長檢測器，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃；流速1 mL/min；流動相為乙腈-20 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.7）體積比18∶82；進樣量20 μL。

1.3.4 抗氧化能力分析

1.3.4.1 Fe3+還原力的測定

取鐵皮石斛多糖樣品復溶，進行抗氧化能力的分析。設置多糖質量濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL。取不同質量濃度的多糖提取液200 μL，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）500 μL，加入1%鐵氰化鉀溶液500 μL，混合后50 ℃放置20 min，流水冷卻，加入10%三氯乙酸溶液500 μL混合，4 000 r/min離心10 min后，取上清液600 μL，依次加入蒸餾水600 μL和0.1%三氯化鐵溶液120 μL，混勻，靜置10 min，以蒸餾水作為樣品對照，于700 nm波長處測定吸光度[26]。Fe3+還原力按公式（1）計算：

式中：A1為樣品溶液吸光度；A0為對照組加蒸餾水樣液的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測定

取不同質量濃度的多糖提取液500 μL與等體積的0.2 mg/mL的DPPH-無水乙醇溶液均勻混合，暗處理30 min后，以蒸餾水為參比，測定其517 nm波長處吸光度[27]。DPPH自由基清除率按公式（2）進行計算：

式中：A0為500 μL蒸餾水代替多糖提取液與500 μL DPPH反應后的吸光度；A1為500 μL DPPH+500 μL多糖提取液反應后的吸光度；A2為500 μL多糖提取液+500 μL無水乙醇反應后的吸光度。

1.3.4.3 羥自由基清除率的測定

在離心管中依次加入2 mg/mL硫酸亞鐵溶液250 μL，1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液250 μL，加入不同質量濃度的多糖提取液250 μL、1%的過氧化氫250 μL，混和振蕩，37 ℃保溫1 h，于526 nm波長處測定其吸光度[28]。羥自由基清除率按公式（3）進行計算：

式中：C1為樣品組吸光度；C2為無水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光度；C0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.4.4 T-AOC的測定

使用T-AOC試劑盒，按照T-AOC測定試劑盒中的操作方法測定不同質量濃度多糖提取液的T-AOC。

2 結果與分析

2.1 不同種植年限鐵皮石斛多糖含量

圖1 不同種植年限鐵皮石斛多糖含量Fig. 1 Polysaccharide contents of different aged Dendrobium oきcinale

如圖1所示，不同種植年限鐵皮石斛中多糖含量由高到低依次為5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，5 a生多糖含量為238.60 mg/g，3 a生為232.74 mg/g。通過統計分析可得，1 a生鐵皮石斛中的多糖含量與其他4 種的多糖含量均存在顯著性差異，3 a生樣品中多糖含量與5 a生樣品之間不存在顯著性差異。諸燕等[29]研究結果表明，不同生長年限鐵皮石斛中的多糖含量存在差異，2 a生和3 a生多糖的含量較高，但是對于3 a生后的鐵皮石斛多糖含量的變化未做出相關研究。

2.2 不同種植年限鐵皮石斛多糖分子質量

表1 不同種植年限鐵皮石斛多糖分子質量Table 1 Molecular weights of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

如表1所示，不同種植年限鐵皮石斛中的多糖為非均一成分，2 種多糖組分在含量、分子質量上均存在差異，多糖組分1在鐵皮石斛多糖中含量最高，分子質量也最大。其中4 a生鐵皮石斛多糖組分的分子質量最大，主要多糖組分分子質量為1 383 kDa；其次是3 a生鐵皮石斛多糖，主要多糖組分分子質量為1 046 kDa。

2.3 不同種植年限鐵皮石斛多糖單糖組成

圖2 不同種植年限鐵皮石斛多糖單糖組成液相色譜圖Fig. 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

由圖2可知，1 a生、2 a生、3 a生、4 a生、5 a生鐵皮石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，其物質的量比分別為4.3∶1、2.3∶1、3.1∶1、2.1∶1、1.8∶1。周桂芬等[30]研究表明，隨著生長年限增加，甘露糖含量降低。《中國藥典》規定鐵皮石斛多糖色譜圖中，甘露糖和葡萄糖的峰面積比應為2.4∶1～8.0∶1，1 a生和3 a生多糖符合此標準規定值。

2.4 不同種植年限鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性結果

圖3 不同種植年限鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activities in vitro of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale

如圖3所示，不同種植年限的鐵皮石斛粗多糖均表現出較強的抗氧化活性，且隨著多糖質量濃度的增大也逐漸增強。但不同種植年限鐵皮石斛多糖在不同的抗氧化體系中，其抗氧化活性存在差異。當多糖質量濃度為2 mg/mL及以上時，3 a生鐵皮石斛多糖對Fe3+還原能力和T-AOC最高，分別為0.23和1.18 U/mL（多糖質量濃度為3 mg/mL），多糖質量濃度高于1 mg/mL時，對羥自由基的清除能力最強，清除率為69.3%（多糖質量濃度為3 mg/mL）。就多糖對DPPH自由基的清除作用而言，5 a生多糖效果最好，清除率最高為50.63%（多糖質量濃度為3 mg/mL），3 a生多糖次之，為44.3%。

3 結 論

實驗研究表明，不同種植年限鐵皮石斛多糖的含量、分子質量、單糖組成以及抗氧化能力方面均存在差異。1～5 a生多糖含量依次為5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，含量最高的為5 a生鐵皮石斛為238.60 mg/g，3 a生為232.74 mg/g。3 a生和4 a生多糖的分子質量最高，分別為1 046 kDa和1 383 kDa。1 a生多糖的甘露糖和葡萄糖的物質的量比最高，為4.3∶1，其次是3 a生多糖，為3.1∶1。在抗氧化能力方面，各種多糖均呈現出明顯的量效正相關關系，總體上來看，3 a生多糖對Fe3+的還原、羥自由基的清除、T-AOC較強。綜合各方面可得，鐵皮石斛的最佳種植年限是3 a，為進一步探究鐵皮石斛多糖的特性和積累規律提供了理論基礎。

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