芪黃煎劑對(duì)胃切除大鼠腸淋巴細(xì)胞MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表達(dá)的影響

張 琦，于慶生，周富海，沈 毅，劉舉達(dá)，王 振，黃 龍

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院外科研究所，安徽 合肥 230031)

當(dāng)機(jī)體受到外源性損傷、手術(shù)或感染毒性物質(zhì)等打擊時(shí)，機(jī)體應(yīng)激后可以導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，從而導(dǎo)致細(xì)菌移位，引發(fā)腸源性全身感染和膿毒血癥，內(nèi)源性免疫炎性因子可形成“瀑布效應(yīng)”，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征。因此，臨床上開展了大量以藥物干預(yù)保護(hù)腸黏膜屏障的相關(guān)研究，中醫(yī)藥在保護(hù)腸黏膜屏障中起到重要的作用。以往研究表明，芪黃煎劑對(duì)大鼠胃切除后腸黏膜淋巴細(xì)胞免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用[1-2]。腸淋巴細(xì)胞歸巢在腸黏膜的保護(hù)作用中是決定性的環(huán)節(jié)[3-4]。筆者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察芪黃煎劑對(duì)腸黏膜地址素細(xì)胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhension molecule-1，MAdCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及其mRNA表達(dá)的影響，探討其保護(hù)腸黏膜屏障的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，60只，7周齡，體質(zhì)量290～310 g。由安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2015-002。

1.2 藥品 芪黃煎劑(由黃芪、黨參、白術(shù)、大黃、厚樸、枳實(shí)、黃芩、丹參組成，質(zhì)量比為20∶20∶20∶10∶10∶10∶12∶15，總質(zhì)量為234 g)：飲片均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供，經(jīng)過煎煮、過濾、濃縮，制成1.0 g/mL的生藥煎劑，放入4 ℃冰箱內(nèi)保存，給藥前復(fù)溫至30 ℃。腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑能全素(整蛋白型粉劑)：荷蘭紐迪希亞出口有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為H20140007。

1.3 試劑 ICAM-1(bs-0608R)兔抗大鼠單克隆抗體(批號(hào)9988520W)、MAdCAM-1(bs-11179R)兔抗大鼠單克隆抗體(批號(hào)9957416W)：北京博奧森生物工程有限公司；D-Hank液(批號(hào)20100927)：Solarbio公司；胎牛血清(批號(hào)090506)：杭州四季青生物工程材料有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit，批號(hào)00145205)：杭州主諾生物技術(shù)有限公司；GoldView核酸染料(批號(hào)130618)：賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 電子天平(島津AUY120)：日本；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)2-16KL)：廣州市百菱生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀(EPICS XL-MCL 4C)：美國(guó)COULTER公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：美國(guó)Thermo；醫(yī)用Olympus顯微照相設(shè)備(PM-20型)：Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制、分組及給藥 將大鼠適用性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為3組，分別是假手術(shù)組、模型組、芪黃煎劑組，每組20只。參照課題組既往研究方法[1-2,5]，模型組、芪黃煎劑組均行胃切除術(shù)。用10%無菌水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后將大鼠仰臥位固定，剪除腹毛，75%乙醇無菌操作，術(shù)者戴無菌手套，鋪無菌洞巾，沿腹部正中切口剪開皮膚、肌肉，暴露腹腔胃體部，切除部分胃體前壁后，用絲線全層縫合。將距離屈氏韌帶10 cm處的空腸前壁用12號(hào)注射器針頭戳孔，行小腸造瘺，將直徑1.0 mm硅膠導(dǎo)管自戳孔處置入空腸并固定，腹壁戳口經(jīng)皮下隧道后引出于后背部，作為給藥途徑，放置彈簧保護(hù)裝置縫合固定于皮膚。假手術(shù)組大鼠不予以胃切除，僅行腹部正中切開后隨即縫合。手術(shù)清醒后置籠內(nèi)自由活動(dòng)，仔細(xì)觀察大鼠一般情況。其中模型組僅給予能全素腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，即手術(shù)當(dāng)天禁食、禁水，術(shù)后第1天開始給藥，通過硅膠管用10 mL注射器通過微量注射泵緩慢、勻速、持續(xù)注入小腸內(nèi)。每日能全素腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)量=[(120 kJ/(kg·d)×0.3 kg)]/(8.3 kJ/mL)=4.3 mL/d。計(jì)算依據(jù)：按120 kJ/(kg·d)提供熱量，160 g能全素用溫開水溶解成500 mL溶液，每100 mL含830 kJ熱量，每只大鼠按300 g計(jì)算。每日2次滴注，速度控制為2 mL/h，連續(xù)應(yīng)用1周。滴注完成后以2 mL生理鹽水封管，防止硅膠管堵塞。芪黃煎劑組大鼠胃切除后在滴注營(yíng)養(yǎng)液能全素前給予約6 mL中藥芪黃煎劑，按20 g/kg換算，給藥方法完全同模型組。假手術(shù)組大鼠不給予能全素和芪黃煎劑滴注。

2.2 標(biāo)本制作與指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 標(biāo)本采集 干預(yù)1周后，開腹前操作步驟與復(fù)制大鼠手術(shù)創(chuàng)傷模型的方法相同,進(jìn)入腹腔后，借助放大鏡尋找腸淋巴干，針頭刺入后引流淋巴液以備用。然后分離PP結(jié)，即將淋巴液引流完成后，腹腔內(nèi)分離取出整個(gè)小腸放置于培養(yǎng)皿中，生理鹽水沖洗直至干凈，再用含5%胎牛血清的D-Hank液沖洗腸道2遍，再次放置培養(yǎng)皿中。經(jīng)肉眼辨認(rèn)后，用剪刀剪下PP結(jié)，將一半PP結(jié)用10%甲醛固定，用作MAdCAM-1、ICAM-1蛋白含量檢測(cè)。將另一半PP結(jié)置于凍存管中，放入-80 ℃冰箱凍存，用于檢測(cè)MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 采用熒光定量PCR儀檢測(cè)PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA。將溫度與熒光強(qiáng)度變化求導(dǎo)(單峰熔解曲線)。在整個(gè)PCR完成后進(jìn)行熔解曲線的設(shè)置，溫度從60 ℃升至95 ℃，每升高1 ℃儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到的熔解曲線是逐漸下降的過程，在Tm值下降最快。首先求出樣品目的基因的Ct值，再求出內(nèi)參照β-actin基因的平均Ct值，應(yīng)用參照基因β-actin對(duì)未處理樣品和藥物處理樣品進(jìn)行校正，然后對(duì)未處理樣品和藥物處理樣品的ΔCt進(jìn)行歸一化：ΔΔCt=ΔCt(藥物處理樣品)-ΔCt(未處理樣品)。最后，根據(jù)ΔΔCt算出藥物處理樣品與未處理樣品間基因的表達(dá)差異，并表示為2-ΔΔCt值。

注：RT-PCR引物合成序列進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

MAdCAM-1：擴(kuò)增長(zhǎng)度為118 bp，退火溫度為58 ℃。

正鏈：5′-GGCAGGTGACCAGTCTGTATGTT-3′；

反鏈：5′-CAGTAGGCAAGGAAGGCGAGT-3′。

ICAM-1：擴(kuò)增長(zhǎng)度為161 bp，退火溫度為58 ℃。

正鏈：5′-CTGGAGAGCACAAACAGCAGAGAT-3′；

反鏈：5′-ATGGGAGCTGAAAAGTTGTAGATTC-3′。

采用常規(guī)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1的表達(dá)水平，PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1表達(dá)陽性的細(xì)胞胞膜呈現(xiàn)棕黃色。采用通用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件2.0(北京中科恒業(yè)科技有限公司)，參照使用說明，采用雙盲方式于顯微鏡下計(jì)數(shù)切片中各視野內(nèi)棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)量，每只大鼠選取1張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(10×40倍)，取5個(gè)視野的平均值，以平均值作為單個(gè)大鼠的表達(dá)水平，以某組所有大鼠表達(dá)水平的均數(shù)作為該組大鼠的表達(dá)水平。計(jì)算出每只大鼠平均每個(gè)視野MAdCAM-1、ICAM-1陽性表達(dá)的光密度值。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組MAdCAM-1、ICAM-1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芪黃煎劑組MAdCAM-1、ICAM-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1和圖1、圖2。

3.2 3組大鼠PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芪黃煎劑組MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表1 3組大鼠PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1 表達(dá)水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；OD(optical density)：光密度

注：A．假手術(shù)組；B．模型組；C．芪黃煎劑組圖1 3組大鼠PP結(jié)中MAdCAM?1表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

注：A．假手術(shù)組；B．模型組；C．芪黃煎劑組圖2 3組大鼠PP結(jié)中ICAM?1表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

表2 3組大鼠PP結(jié)中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

腸黏膜發(fā)揮免疫效應(yīng)是通過腸淋巴細(xì)胞歸巢實(shí)現(xiàn)的[3,6]。其分子基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞歸巢受體與配體的相互辨認(rèn)與結(jié)合。此過程中配體作為血管內(nèi)皮細(xì)胞地址素，在介導(dǎo)淋巴細(xì)胞向黏膜部位的定向歸巢中發(fā)揮重要作用。淋巴細(xì)胞歸巢中最具有代表性的兩種配體為MAdCAM-1與ICAM-1。MAdCAM-1是一種分子量為60 kD的糖蛋白，是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一員，主要表達(dá)于腸道黏膜相關(guān)淋巴組織[7]，識(shí)別和介導(dǎo)歸巢受體α4β7和L-選擇素。MAdCAM-1選擇性表達(dá)于PP結(jié)及腸黏膜固有層的高內(nèi)皮靜脈(high endothelial venules，HEV)，其分子基礎(chǔ)是同淋巴細(xì)胞上的歸巢受體分子整合素α4β7結(jié)合后向黏膜部位定向歸巢。ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族，分子量70～110 kD的跨膜糖蛋白，細(xì)胞分化群是CD54，它通過與其受體的特異性結(jié)合，使白細(xì)胞、炎性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化。ICAM-1識(shí)別和介導(dǎo)歸巢受體淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1)，二者結(jié)合后介導(dǎo)淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上[8-9]。

淋巴細(xì)胞歸巢配體MAdCAM-1與ICAM-1作為一種重要的細(xì)胞間黏附分子，對(duì)其分子數(shù)量與基因表達(dá)的干預(yù)決定了其歸巢的過程。通常干預(yù)的過程可以受到單克隆抗體、細(xì)胞因子、藥物及腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)等的影響[10-11]。李凱等[12]應(yīng)用參青方治療潰瘍性結(jié)腸炎，通過藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)模型組MAdCAM-1蛋白表達(dá)與基因轉(zhuǎn)錄水平均高于正常組，經(jīng)用中藥干預(yù)治療后，MAdCAM-1的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。參青方能夠阻斷MAdCAM-1與其受體結(jié)合，即阻斷淋巴細(xì)胞定向歸巢過程，使本病的炎癥-免疫反應(yīng)顯著下調(diào)，因此認(rèn)為其治療作用機(jī)制與降低MAdCAM-1在結(jié)腸黏膜的表達(dá)有關(guān)。翟金海等[13]觀察發(fā)現(xiàn)，清腸化濕方可以顯著減少大鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸黏膜ICAM-1的表達(dá)，從而減少炎性細(xì)胞表面高表達(dá)的ICAM-1與受體LFA-1相互接觸、相互作用，減少T淋巴細(xì)胞的活化、靶細(xì)胞的殺傷引起的炎性反應(yīng)。彭蘭等[7]研究表明，早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可以明顯增加SD大鼠腸道MAdCAM-1表達(dá)，可使淋巴細(xì)胞上的配體分子整合素與之結(jié)合所形成的復(fù)合物在向黏膜部位的定向歸巢中發(fā)揮重要作用，從而顯著保護(hù)大鼠重癥急性胰腺炎腸道屏障。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芪黃煎劑組歸巢分子配體MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05)。這說明經(jīng)中藥干預(yù)后，可促使黏附分子的游出，從而增加黏附分子相對(duì)表達(dá)水平。由此可見，芪黃煎劑能增加腸黏膜效應(yīng)部位MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表達(dá)水平。

脾主運(yùn)化，為“氣血生化之源”，胃為“水谷之海”，脾、胃同居中焦。胃腸術(shù)后，脾胃受損可出現(xiàn)納差、便溏、面色蒼白、舌淡苔白、脈細(xì)弱等脾虛證候，同時(shí)胃的受納水谷功能尚未恢復(fù)，又有腑實(shí)氣滯表現(xiàn)，如進(jìn)食后腹部脹痛、肛門停止排氣排便。因此，胃腸術(shù)后脾虛與腑實(shí)并存，辨證為虛實(shí)夾雜證[14]。本課題組前期也對(duì)胃腸術(shù)后患者進(jìn)行了觀察研究[5,15]，辨證立法為攻補(bǔ)兼施，補(bǔ)則基于李東垣《脾胃論》補(bǔ)中益氣湯思想，攻則基于張仲景《傷寒雜病論》大承氣湯思想，二者結(jié)合構(gòu)建了健脾通里方——芪黃煎劑。該方由健脾藥物黃芪、白術(shù)、黨參與通里攻下藥物大黃、枳實(shí)、厚樸等組成。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性與特異性免疫功能、增強(qiáng)機(jī)體耐低氧及應(yīng)激能力等多種藥理功效，可促進(jìn)胃腸道黏膜淋巴細(xì)胞的歸巢表達(dá)，從而修復(fù)胃腸黏膜免疫細(xì)胞增殖、分化，起到免疫黏膜屏障修復(fù)作用。盛恒煒等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪預(yù)處理能夠明顯減輕因小腸缺血再灌注損傷所引起的ICAM-1蛋白高表達(dá)。張?chǎng)斡甑萚17]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能減輕梗阻性黃疸所致的肝功能損害，對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低肝細(xì)胞內(nèi)TNF-α、ICAM-1表達(dá)有關(guān)。大黃具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效，大黃與烏司他丁聯(lián)合應(yīng)用能明顯降低急性呼吸窘迫綜合征患者ICAM-1水平，從而起到對(duì)急性呼吸窘迫綜合征的保護(hù)作用[18]。

通過本實(shí)驗(yàn)可推斷歸巢受體與配體的辨認(rèn)與結(jié)合，是腸淋巴細(xì)胞得以歸巢的分子基礎(chǔ)。而腸固有層或上皮內(nèi)歸巢配體MAdCAM-1、ICAM-1在此過程起到重要作用，使腸黏膜地址素更能捕獲歸巢受體。本實(shí)驗(yàn)表明，芪黃煎劑能增加腸黏膜效應(yīng)部位MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表達(dá)水平，從而促進(jìn)腸淋巴細(xì)胞歸巢過程。該過程順利實(shí)現(xiàn)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞的分化、成熟和增殖、活化，從而保護(hù)胃切除術(shù)后腸黏膜免疫屏障，以發(fā)揮對(duì)腸黏膜的防御和維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的療效。

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