新魚(yú)腥草素鈉對(duì)小鼠鮑曼不動(dòng)桿菌肺感染模型的保護(hù)作用

張怡敏，周雪寧，張宏方，環(huán) 誠(chéng)，葉崢嶸

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物及檢驗(yàn)教研室，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌[1-2]。研究[3]表明，鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，主要存在于重癥監(jiān)護(hù)病房和呼吸科，常引起呼吸系統(tǒng)感染，也可引發(fā)菌血癥、手術(shù)部位感染等。鮑曼不動(dòng)桿菌感染致死率接近50%。此外，由于細(xì)菌耐藥的現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，鮑曼不動(dòng)桿菌的治療變得愈加困難[4]。因此，臨床上迫切需要發(fā)展針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的新療法和干預(yù)策略。

魚(yú)腥草是一種傳統(tǒng)中藥，其性味辛寒，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等功效，可用于治療肺膿潰瘍、肺熱咳喘、熱痢熱淋、水腫、腳氣、尿路感染、癰腫瘡毒等癥，因此魚(yú)腥草往往用于治療肺病、泌尿系統(tǒng)疾病[5-6]。魚(yú)腥草素是傳統(tǒng)中藥魚(yú)腥草的主要活性成分，化學(xué)名稱為癸酰乙醛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用[7]。由于該物質(zhì)不穩(wěn)定，目前臨床上常使用十二酰乙醛的亞硫酸氫鈉加成物，即新魚(yú)腥草素鈉。本研究通過(guò)制備小鼠鮑曼不動(dòng)桿菌感染的肺炎模型，預(yù)先給予新魚(yú)腥草素鈉治療，觀察魚(yú)腥草素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌性肺炎的防治效果。

1 材料

1.1 動(dòng)物 80只雄性C57BL/6小鼠，8～12周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(小鼠合格證編號(hào):20150073)，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，能夠自由攝取食物和飲水。

1.2 菌株 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房分離的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，經(jīng)過(guò)法國(guó)生物梅里埃API鑒定系統(tǒng)常規(guī)鑒定。

1.3 試劑 小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β) ELISA檢測(cè)試劑盒：上海潤(rùn)裕生物科技有限公司；新魚(yú)腥草素鈉注射液：江西瑞金三九藥業(yè)有限公司。

1.4 儀器 BX53M光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Appliskan 多功能讀數(shù)儀：美國(guó)賽默飛世爾公司。

2 方法

2.1 菌液制備 將臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌接種至瓊脂糖培養(yǎng)板，放置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至含5～8 mL LB培養(yǎng)液的搖菌管中，置于搖床中37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，取5 mL細(xì)菌液4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，采用1 mL無(wú)菌生理鹽水重懸，用比濁法測(cè)定并調(diào)整菌液濃度為1×108集落形成單位(colony-forming units， CFU)/mL。

2.2 模型制備 80只C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分為對(duì)照組、肺炎模型組、低劑量(5 mg/kg)新魚(yú)腥草素鈉組和高劑量(10 mg/kg)新魚(yú)腥草素鈉組，每組20只，各組小鼠于模型制備前4 d和前1 d，通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg) ，以抑制小鼠免疫功能，其中低劑量新魚(yú)腥草素鈉組和高劑量新魚(yú)腥草素鈉組在手術(shù)前4 d開(kāi)始每天通過(guò)腹腔注射給予新魚(yú)腥草素鈉注射液，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。小鼠經(jīng)4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，用注射器將100 μL菌液注入氣道，對(duì)照組注射等量生理鹽水，注射完畢，待小鼠復(fù)蘇后正常飼養(yǎng)，觀察小鼠生存狀態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)[8]介紹的方法進(jìn)行，若小鼠接種后出現(xiàn)明顯的呼吸急促、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)雜亂等表現(xiàn)，表明模型復(fù)制成功。

2.3 細(xì)菌學(xué)定量 在接種后24、72 h每組分別用頸椎脫臼方式處死5只小鼠，摘除肺組織，加入適量無(wú)菌生理鹽水后勻漿，通過(guò)70 μm孔徑的濾膜過(guò)濾，用無(wú)菌生理鹽水10倍稀釋后取100 μL樣品接種至瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌的菌落數(shù)量。

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)觀察 每組各取小鼠5只，在接種后72 h處死小鼠，收集右側(cè)肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察比較各組小鼠肺組織病理學(xué)變化。

2.5 支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎性細(xì)胞檢測(cè) 每組各取小鼠5只，同樣方法麻醉小鼠，切開(kāi)氣管，注入0.5 mL PBS溶液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次。將回收到的液體混勻，收集BALF中全部細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，Hema-3染色后用細(xì)胞涂片進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)。

2.6 ELISA檢測(cè) 每組各取小鼠5只，小鼠處死前通過(guò)心臟采血方法收集1 mL血液，分離血清，檢測(cè)血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠狀態(tài)觀察 在麻醉、插管、接種等操作過(guò)程中無(wú)小鼠死亡，對(duì)照組小鼠活動(dòng)、進(jìn)食無(wú)異常。肺炎模型組小鼠接種鮑曼不動(dòng)桿菌后6 h，出現(xiàn)明顯的呼吸急促、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍的表現(xiàn)；接種后24 h，上述癥狀進(jìn)一步加重，并出現(xiàn)攝食減少、毛發(fā)雜亂、蜷縮、渾身顫抖等病變加重的征象；72 h后小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難、反應(yīng)遲鈍、渾身顫抖、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。新魚(yú)腥草素鈉組小鼠接種鮑曼不動(dòng)桿菌后也出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)減少的現(xiàn)象，但是與肺炎模型組相比，癥狀較為輕微。

3.2 各組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌計(jì)數(shù)比較 在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，對(duì)照組小鼠肺組織中未檢出細(xì)菌，肺炎模型組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)。新魚(yú)腥草素鈉組小鼠肺內(nèi)和血液中細(xì)菌數(shù)量明顯少于肺炎模型組(P<0.05)，其中高劑量新魚(yú)腥草素鈉組治療效果優(yōu)于低劑量新魚(yú)腥草素鈉組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠接種鮑曼不動(dòng)桿菌后肺內(nèi)和血液中細(xì)菌計(jì)數(shù)

注：與肺炎模型組比較，*P<0.05；與低劑量新魚(yú)腥草素鈉組比較，#P<0.05

3.3 各組小鼠肺組織病理觀察 肺炎模型組小鼠術(shù)后72 h肺組織呈現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥變化，包括支氣管管壁增厚、支氣管擴(kuò)張、單核細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)重度充血等典型的肺炎病理改變。在給予新魚(yú)腥草素鈉治療后，小鼠肺部炎癥明顯減輕，表現(xiàn)為少量的間質(zhì)充血、水腫和白細(xì)胞滲出。而高劑量新魚(yú)腥草素鈉治療的效果更為明顯。見(jiàn)圖1。

3.4 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞水平比較 與對(duì)照組相比，肺炎模型組小鼠BALF中炎性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)；與肺炎模型組相比，經(jīng)過(guò)新魚(yú)腥草素鈉治療的小鼠BALF中炎性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，其中中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的比例也更高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

注：A.對(duì)照組；B.肺炎模型組；C.低劑量新魚(yú)腥草素鈉組；D.高劑量新魚(yú)腥草素鈉組

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與肺炎模型組比較，*P<0.05

3.5 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比較 與對(duì)照組比較，肺炎模型組小鼠TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；在給予新魚(yú)腥草素鈉治療后，治療組BALF中TNF-α、IL-1β水平均高于肺炎模型組(P<0.05)，其中高劑量新魚(yú)腥草素鈉組又明顯高于低劑量新魚(yú)腥草素鈉組(P<0.05)。結(jié)果提示新魚(yú)腥草素鈉對(duì)小鼠免疫功能的促進(jìn)作用具有劑量依賴性。見(jiàn)表3。

4 討論

隨著臨床大量抗生素的應(yīng)用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性愈加嚴(yán)重，鮑曼不動(dòng)桿菌感染已經(jīng)成為臨床難控制的感染性疾病之一[9-11]。開(kāi)發(fā)新的有效藥物控制鮑曼不動(dòng)桿菌感染是目前研究的重要方向。由于鮑曼不動(dòng)桿菌是機(jī)會(huì)致病菌，通常情況下不會(huì)導(dǎo)致免疫力正常的人和動(dòng)物致病。針對(duì)這一問(wèn)題，在本實(shí)驗(yàn)中預(yù)先給予小鼠環(huán)磷酰胺處理。環(huán)磷酰胺是常用的烷化劑類(lèi)免疫抑制劑，常用于器官移植或者自身免疫性疾病[12]，經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠體內(nèi)免疫功能下降，使得鮑曼不動(dòng)桿菌能夠成功感染小鼠。在本研究中，筆者利用臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株通過(guò)呼吸道接種的方式制備了小鼠肺炎模型。鮑曼不動(dòng)桿菌可以在小鼠肺內(nèi)增殖并在肺外快速傳播，導(dǎo)致小鼠發(fā)生菌血癥和肺炎。這種模型一定程度上模擬了臨床鮑曼不動(dòng)桿菌感染導(dǎo)致肺炎的病理過(guò)程。

表3 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比較

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與肺炎模型組比較，

*P<0.05；與低劑量新魚(yú)腥草素鈉組比較，#P<0.05

新魚(yú)腥草素鈉在臨床上作為重要的輔助用藥常用于呼吸系統(tǒng)感染性疾病的治療，對(duì)卡他球菌、流感桿菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌等有明顯抑制作用[13-17]。研究表明，其能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抑制病原微生物以及抗腫瘤作用[18-19]。在本研究中，小鼠接種大量鮑曼不動(dòng)桿菌后，肺和血液中細(xì)菌增加，由于自身免疫功能受到抑制，白細(xì)胞數(shù)量不足，不能夠充分激活固有免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為白細(xì)胞升高受限，釋放細(xì)胞因子不足，其結(jié)果是不能夠快速清除體內(nèi)細(xì)菌，造成肺嚴(yán)重的炎性反應(yīng)和組織損傷，而經(jīng)過(guò)新魚(yú)腥草素鈉治療的小鼠，肺內(nèi)和血循環(huán)中細(xì)菌的數(shù)量顯著減少，肺組織損傷程度較輕微，BALF中白細(xì)胞數(shù)量顯著高于未給予新魚(yú)腥草素鈉治療的小鼠，TNF-α和IL-1β作為急性炎癥過(guò)程中重要細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生，因此這兩種細(xì)胞因子水平反映炎性反應(yīng)程度以及單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能。肺炎模型組小鼠經(jīng)過(guò)環(huán)磷酰胺處理，其炎性反應(yīng)受到一定程度的抑制，但仍能夠增生和活化，而新魚(yú)腥草素鈉治療后，小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)能力顯著提高，表現(xiàn)為細(xì)胞因子水平增加更為明顯，說(shuō)明新魚(yú)腥草素鈉能夠提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)白細(xì)胞活化，增加細(xì)胞因子分泌。

綜上，本次研究結(jié)果表明，新魚(yú)腥草素鈉能夠顯著改善鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠的免疫力并抑制鮑曼不動(dòng)桿菌在體內(nèi)增殖，針對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究可望為鮑曼不動(dòng)桿菌的防治提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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