Box-Behnken響應面設計法優化排膿散水提工藝

孫 寒，梁 笑，桂雙英,2,3

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；3.新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

排膿散出自于《金匱要略》，由枳實、芍藥和桔梗3味中藥按3∶3∶1的配伍比例組成，具有排膿化毒、止痛、調理氣血之功效，臨床用于瘡癰、腸癰等癥的治療[1]。目前關于排膿散提取工藝的研究報道較少，本試驗選取排膿散中3個指標性成分柚皮苷、新陳皮苷、芍藥苷的含量結合出膏率作為考察指標，采用Box-Behnken響應面法優化排膿散水提工藝，優選排膿散水提取工藝的最佳工藝參數，為本方的進一步開發研究提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 LC-20ADXR液相色譜儀：日本島津儀器有限公司；電子天平(型號：PA1004B)：上海越平科學儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋(型號：WB-2000)：鄭州長城科工貿有限公司；數控超聲波清洗器(型號：KQ2200)：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司； CP2250分析天平(精度：0.01 mg)：奧豪斯國際貿易有限公司。

1.2 試劑與藥材 柚皮苷對照品(批號 110722-201613)、新橙皮苷對照品(批號 111857-201102)、芍藥苷對照品(批號 110736-201539)：中國食品藥品檢定研究院；枳實(批號 1612013183)、白芍(批號 1608018158)藥材購于安徽省中醫院，桔梗(批號 1611016176)藥材購于安徽省安慶華氏中藥飲片公司，按2015版《中華人民共和國藥典》含量測定法檢測，均符合要求；Milli-Q一體式超純水機(美國Milipore公司)；甲醇(≥99.9%，批號 Me-12760216)、乙腈(≥99.9%，批號 AC-12960217)：瑞典Oceanpak公司。

2 方法與結果

2.1 指標成分的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定柚皮苷4.32 mg、新橙皮苷1.46 mg、芍藥苷12.33 mg，分別加入甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，分別精密移取各對照品溶液適量混勻，加甲醇稀釋制成含柚皮苷86.4 μg/mL、新橙皮苷43.8 μg/mL、芍藥苷86 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取中藥飲片35 g，以水為提取溶劑，根據Box-Behnken試驗設計表(見表1)回流提取，每次提取后濾過，合并濾液，濃縮定容至100 mL，精密量取5 mL，用純水定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得各提取液的供試品溶液。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平

2.2 色譜及檢測條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～12 min，15%～20%(A)；12～15 min，20%～25%(A)；15～18 min，25%～20%(A)；18～21 min，20%～15%(A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm(測定柚皮苷、新橙皮苷)，230 nm(測定芍藥苷)；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數大于3 000，各指標成分與其他成分的吸收峰達到良好分離，分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1空白甲醇(A)、混合對照品(B)、供試品(C)的高效液相色譜圖(1.芍藥苷；2.柚皮苷；3.新橙皮苷)

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量于2 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成柚皮苷濃度分別為86.4、43.2、21.6、10.8、5.4、2.7 μg/mL，新橙皮苷濃度分別為43.8、21.9、10.95、5.475、2.737 5、1.368 8 μg/mL，芍藥苷濃度分別為86、43、21.5、10.75、5.375、2.687 5 μg/mL的一系列混合對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過。按“2.2”項下方法進行測定。以進樣量(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，分別得到柚皮苷、新橙皮苷和芍藥苷的回歸方程：y柚皮苷=25 235x-12 013(r=0.999 5)，y新陳皮苷=23 702x-5 000.7(r=0.999 5)，y芍藥苷=16 661x-18 964(r=0.999 6)，表明柚皮苷進樣量在0.05～1.73 μg，新橙皮苷進樣量在0.03～0.88 μg，芍藥苷進樣量在0.05～1.72 μg范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液20 μL，連續進樣6次，計算柚皮苷的峰面積RSD為0.13%，新橙皮苷的峰面積RSD為0.12%，芍藥苷的峰面積RSD為0.48%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液6份，分別放置0、2、4、6、8、12、24、36 h后進樣。計算柚皮苷的峰面積RSD為0.50%，新橙皮苷的峰面積RSD為0.67%，芍藥苷的峰面積RSD為0.31%。結果表明供試品溶液在36 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 按處方比例稱取藥材6份，每份35 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依次進樣，記錄色譜圖。計算柚皮苷的峰面積RSD為1.20%，新橙皮苷的峰面積RSD為1.29%，芍藥苷的峰面積RSD為1.35%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量的柚皮苷、新橙皮苷、芍藥苷對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣，測定。柚皮苷平均回收率為102.6%，RSD為2.24%；新橙皮苷平均回收率為101.4%，RSD為1.98%；芍藥苷平均回收率為103.9%，RSD為2.16%。結果表明本方法回收率良好。

2.4 出膏率的測定 精密吸取供試品溶液20 mL，置已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于真空干燥箱中烘干至恒質量，取出，移置干燥器中，冷卻，迅速稱質量，計算出膏率。

2.5 Box-Behnken響應面法優化提取工藝

2.5.1 設計方案 以水為提取溶劑，以料液比(x1)、提取時間(x2)、提取溫度(x3)3個考察因素，以柚皮苷(y1)、新橙皮苷(y2)、芍藥苷(y3)及浸膏得率(y4)為評價指標，采用Box-Behnken響應面優化提取工藝，考慮提取次數為非連續型變量，回歸處理較困難，因此固定提取次數為2次。試驗結果見表2。

表2 用于提取工藝優化的Box-Behnken設計結果

注：OD =(d1×d2×…×dn)1/n，n為指標數；di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，yi為實測值，ymin和ymax為某一指標在不同試驗中的最小值和最大值

2.5.2 試驗結果與數據分析 采用Hassan公式將上述4個指標進行“歸一化”處理[2]，得各指標的幾何均數OD值。

應用Design-Expert 8.0.5軟件對OD值進行多元線性回歸和二次項擬合,得到浸潤時間料液比(x1)、提取時間(x2)、提取溫度(x3)與OD值之間的二次多項回歸方程：OD值=0.86+0.12x1+0.034x2+0.25x3-0.018x1x2-0.063x1x3+0.030x2x3- 0.23x12-0.065x22-0.17x32。

對OD值模型進行方差分析，結果方程決定系數R2=0.994 2，表明該回歸模型的擬合情況良好。由二次回歸模型方差分析結果(見表3)可知，該模型具有高度顯著性(P<0.000 1)，可信度高，失擬項不顯著，說明該模型擬合度較好，可以對不同條件下的目標指標進行預測。此外，一項式中x1、x3達到極顯著水平(P<0.01)，x2達到顯著水平(P<0.05)，x1、x3交互作用顯著(P<0.05)。二項式中x12、x32達到極顯著水平，x22達到顯著水平。

表3 二次回歸模型方差分析結果

2.5.3 響應面優化提取工藝 根據擬合的二次回歸模型，采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制OD值隨因素變化的三維曲面圖和等高線圖，如圖2、圖3、圖4所示。圖2顯示提取時間為60 min時，浸潤時間和料液比對OD值的影響。液料比的最優區域是12～14倍，浸潤時間的最優區域是60～90 min。圖3顯示在料液比為2倍的條件下，浸潤時間和提取時間對OD值的影響，浸潤時間的最優區域是60～90 min，提取時間的最優區域是64～80 min。圖4顯示浸潤時間在60 min條件下，液料比和提取時間對OD值的影響，料液比的最優區域是12～14倍，提取時間的最優區域是64～80 min。

圖2 液料比(x1)和浸潤時間(x2)對OD值影響的等高線圖(左)與響應面圖(右)

圖3 浸潤時間(x2)和提取時間(x3)對OD值影響的等高線圖(左)與響應面圖(右)

圖4液料比(x1)和提取時間(x3)對OD值影響的等高線圖(左)與響應面圖(右)

2.5.4 驗證試驗 結合二次回歸方程，求解得到最佳提取工藝條件為14.85倍水，浸潤67.29 min，提取74.03 min。考慮實際生產工藝，求得的最佳工藝條件均取整數，即15倍水，浸潤67 min，提取74 min。按上述工藝制備3份樣品溶液，測定指標成分含量和出膏率。結果見表4，實測OD值與預測值之間的RSD均小于3%，說明該工藝穩定可靠。同時預測值與實測值偏差較小，表明建立的數學模型預測性較好，可用于篩選出的排膿散水提取工藝。

表4 驗證試驗結果

3 討論

排膿散方劑中君藥枳實和芍藥是常見的藥對，現代研究表明，枳實、芍藥配伍后發揮散結止痛、緩解痙攣、調節血氣作用的主要活性成分是枳實中黃酮類化合物柚皮苷、新橙皮苷，芍藥中的芍藥苷[3-6]。浸膏是中藥藥效的物質基礎，出膏率的變化往往影響有效成分的含量變化[7]，從而影響中藥復方的藥效。因此，本實驗選取了柚皮苷、新橙皮苷、芍藥苷3個活性成分含量與出膏率作為考察指標，并將指標進行歸一化處理，得到OD值，避免了中藥復方提取工藝研究中單一指標評價提取工藝的片面性，較全面地反映指標成分在整體方劑中的作用。

本試驗遵照傳統煎服中藥復方湯劑的方式，選擇水為提取溶劑，回流的方式提取藥液，采用高效液相色譜法測定排膿散中柚皮苷、新橙皮苷、芍藥苷含量，參考文獻[8-10]，考察了乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水共4個流動相系統，綜合考慮色譜峰峰形和磷酸酸度對色譜柱的影響，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水作為流動相。采用Box-Behnken設計優化水提工藝，將數據進行多元二次回歸方程擬合，得到因素與響應值之間的函數關系，解決了非連續、多變量函數處理問題，具有精度高、預測性較好的優勢[11-12]。該法合理、可行，可為進一步開發利用排膿散提供參考依據。

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