低氧脅迫對鰱心肌細胞凋亡及其調控基因Bax、Bcl-2表達的影響

丁晨雨，胡利雙，李 云，薛 洋，李 虹，吳榮華，劉恩秀，李曉潔

(1.西南大學動物科技學院，重慶三峽生態漁業產業技術研究院，重慶 400715；2.西南大學淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400715；3.重慶市水產技術推廣總站，重慶 400200)

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國淡水養殖的主要種類之一，總產量居第二位，具有重要的經濟價值。此外，鰱在水生生物資源養護、修復水域生態和促進漁業增效增收等方面也發揮重要作用[1-2]。但是，鰱性活躍、急躁，受到刺激后應激強烈，耐低氧能力差，養殖生產過程中容易發生泛塘，高密度運輸過程中也容易發生低氧應激、死亡等現象，容易造成經濟損失。了解低氧脅迫下鰱組織或器官的損傷情況及低氧情況下導致鰱死亡的原因可以為鰱抗低氧育種、養殖、運輸等技術的研發提供指導。

細胞凋亡，又被稱為細胞程序性死亡，受特定基因調控，是機體組織為維持適宜的細胞數量而主動自殺的一種死亡方式，在機體正常發育、穩態的維持等過程發揮著重要作用。除此之外，凋亡還發生在許多外界因素誘導的生理和病理過程中：如免疫耐受、腫瘤監控、應激反應等[3]。有研究表明，低氧誘導的氧化應激與細胞凋亡關系密切，nmol水平的活性氧可促進細胞增生，μmol水平的活性氧會引起細胞凋亡，mmol水平的活性氧直接導致細胞死亡[4]。嚴重低氧脅迫下，氧化應激介導的細胞凋亡主要是由死亡受體通路、線粒體通路、內質網通路三個互相聯系的凋亡途徑共同作用發生，NF-κB通路、p53通路等凋亡路徑可能也參與調控[5-7]。魚類機體組織或器官由高度分化的細胞組成，正常生理條件下，凋亡細胞數目較少，組織或器官的功能完整度高，一旦凋亡過度，必將影響其功能。目前，有研究表明低氧脅迫會誘導鰱腦細胞、肝細胞凋亡，團頭魴心臟組織結構變化及線粒體損傷，但是缺氧條件下鰱的心肌細胞損傷狀況還未見報告，是否引起心肌細胞凋亡及凋亡機制也需要了解[8-10]。為此，采用密閉魚缸自發耗氧的方法模擬缺氧環境，首先通過檢測不同低氧條件下鰱血清肌酸激酶(Creatine kinase，CK)的活力判定心肌損傷情況，然后通過TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色法檢測心肌細胞的凋亡情況，進一步用qPCR檢測凋亡調控基因Bax、Bcl-2在心臟組織中表達量的變化，為缺氧誘導的鰱心肌損傷和鰱養殖、運輸、抗低氧育種等研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用鰱購于重慶市沙坪壩區雙連水庫，體長為(23.1±0.8)cm，體重為(212.3±17.2)g。經15 d暫養適應后挑選外觀健康，活力正常，規格一致的鰱用于實驗。實驗開始前先將實驗魚在實驗魚缸中適應24 h，氣泵通氣維持氧濃度。

1.2 實驗設計

以曝氣并通空氣的自來水為實驗用水，將暫養后的鰱隨機分為3組，常氧對照組(Normoxia group，NO)、兩個低氧脅迫實驗組，分別放入120 L的圓形魚缸中，每組設3個平行，每缸放入16尾，總計9缸144尾。實驗水溫控制在(23.0±1.0)℃，實驗組用保鮮膜和塑料蓋密封，NO組持續通空氣。兩組實驗組，其中一組為浮頭實驗組(Hypoxia group，HO)，至實驗魚全部浮頭時采樣，為實驗開始后約4 h，DO值為(1.19±0.17)mg/L。另一組為死亡實驗組(Asphyxia group，AO)，到實驗魚半數死亡時采樣，為實驗開始后約12 h，DO值為(0.38±0.13)mg/L。取樣前用150 mg/L的MS-222麻醉實驗魚以降低應激反應。

1.3 樣品采集與制備

各組隨機取15尾活魚測量體長、體重，然后用一次性滅菌注射器從尾靜脈取血，室溫靜置2 h，待其凝固后3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液制備血清。取血后迅速進行解剖取樣，取其心臟稱重，每組取5尾魚的心臟用4%多聚甲醛溶液固定用于檢測細胞凋亡情況，其余的用液氮研磨，然后用滅菌錫箔紙包裹液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱以備檢測凋亡基因表達。

1.4 實驗方法

血清CK活力采用日立7020全自動生化分析儀檢測，檢測程序按照南京建成生物工程研究所生產的肌酸激酶(CK)測定試劑盒說明書設置。

心肌細胞凋亡用TUNEL染色法[11]對心肌細胞切片進行處理，用Leica DM6000B全自動熒光顯微鏡進行觀察照相，隨機選取視野對凋亡細胞進行計數，計算凋亡指數。

凋亡調控基因Bax、Bcl-2的表達變化采用熒光定量PCR檢測。首先，用總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取凍存的心臟組織總RNA，然后按照Fast Quant RT Kit(with gDNase)(天根生化科技有限公司)操作說明合成cDNA，并根據基因Bax、Bcl-2的序列用Primer Premier5.0設計引物熒光定量PCR所用引物，Bax-F1：5′-CTCTGCTCTTCAACCGACTC-3′，Bax-R1：5′-CGGCACGCAAAGTAGAAA-3′，退火溫度55 ℃；Bcl-2-F1：5′-GCGCAACGCAGCTTCTTA-3′，Bcl-2-R1：5′-GGCATCCCAACCTCCATT-3′，退火溫度59 ℃。熒光定量PCR采用三步法在BIO-RAD CFX ConnectTMOptics Module熒光定量PCR儀中進行，反應體系見表1。

表1 熒光定量PCR反應體系Tab.1 Reaction system for qPCR

反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，引物退火溫度退火20 s，反應40個循環，72 ℃延伸32 s。內參引物為1α-F：5′-TGGGTCGTCCTTGCTGTCT-3′，1α-R：5′-CCCTGCCAACATTACCACTG-3′，做標準曲線分析凋亡調控基因Bax、Bcl-2的表達變化。

1.5 數據分析

實驗數據利用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0統計軟件進行處理，以平均值±標準誤表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法分析，用LSD和Dunnett’s T3進行組間差異比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 低氧脅迫下鰱血清CK活力升高

從表2的結果可以得出，經過不同程度的低氧脅迫后，鰱血清中CK活力隨著氧濃的降低而升高，且低氧脅迫下的兩個實驗組與NO組比較差異顯著(P<0.05)，表明鰱心肌細胞可能產生了損傷。但從HO組處理至AO組時，血清CK活力略有升高，兩組間差異不顯著。

表2 低氧脅迫下鰱血清CK活力變化Tab.2 Changes of serum CK activities in H.molitrix under hypoxia stress

注：肩注中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 低氧脅迫顯著增加鰱心肌細胞凋亡數目

TUNEL法組織學觀察結果如圖1所示，與NO組相比，隨著氧濃度的降低，實驗組鰱心肌組織中正常細胞數目減少，凋亡細胞數目增加，表明低氧脅迫加劇了細胞凋亡的發生。NO組的鰱心肌正常細胞數目遠大于凋亡細胞數目，HO組正常細胞和凋亡細胞細胞數目較為接近，AO組則是正常細胞遠小于凋亡細胞數目。對凋亡細胞計數后的結果表明：NO組細胞凋亡指數為7.69±2.96，HO組細胞凋亡指數為47.94±1.87，AO組細胞凋亡指數為85.39±2.61，三組間差異極顯著(P<0.01)。

圖1 TUNEL法檢測低氧脅迫下鰱心肌細胞凋亡的結果Fig.1 The results of cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL under hypoxia stress in H.molitrix長箭頭所指為正常細胞(藍色細胞核)，短箭頭所指為凋亡細胞(棕褐色細胞核)；放大倍數為400x。

2.3 低氧脅迫升高Bax表達、降低Bcl-2表達

2.3.1 心肌細胞總RNA質量檢測

實驗所提取的心肌總RNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.9 ～ 2.1之間，表明純度較好。1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示，可以看到表示28 S、18 S、5 S的三條亮帶，且28 S亮帶亮度比18 S亮，表明RNA完整性較高。

圖2 鰱心肌總RNA電泳檢測結果Fig.2 Electrophoresis results of total RNA of cardiomyocyte in H.molitrix

2.3.2 心肌中基因Bax、Bcl-2的表達變化

用實時熒光定量PCR的方法研究了常氧和不同低氧脅迫下鰱心肌凋亡調控基因Bax、Bcl-2的表達水平，結果如圖3所示。與NO組相比，低氧脅迫后的HO組和AO組Bax基因表達量增加，AO組表達水平顯著高于NO組和HO組(P<0.05)，表明低氧脅迫激活了促凋亡基因使其表達量上升；Bcl-2的表達量逐漸下降，各組間差異顯著(P<0.05)，表明了低氧脅迫抑制的抗凋亡基因的表達；Bcl-2/Bax隨著氧濃度的降低而下降，組間差異顯著(P<0.05)，表明氧濃度越低鰱心肌細胞凋亡趨勢越顯著。

圖3 低氧脅迫下鰱心臟細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2 mRNA表達量的變化Fig.3 The mRNA expression changes of apoptosis related gene Bax and Bcl-2 under hypoxia stress in H.molitrix heart常氧對照組表示常氧對照組，浮頭實驗組表示實驗魚全部浮頭時期，死亡實驗組表示半數實驗魚死亡時期。不同小寫字母表示低氧處理不同時期同一基因mRNA的差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 低氧脅迫對鰱血清CK活力的影響

溶解氧是影響魚類生存、代謝、生殖、生長發育的重要環境因子。鰱正常生長發育的氧濃度為5.5 mg/L，當溶解氧低于1.75 mg/L時，呼吸會受到抑制，表現出浮頭現象，當溶解氧低于0.26 ～ 0.79 mg/L時，會導致魚窒息死亡[12]。CK廣泛存在于脊椎動物心臟和肌肉組織中，在能量代謝過程中可以催化高能磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之間可逆性轉移，對魚類的生存具有重要作用。由于細胞破裂或壞死后會進入血液，血清CK也常被用來作為衡量心肌細胞損傷程度的指標[13]。魚類對氧濃度較為敏感，特別是鰱，在遭受低氧脅迫時，CK活力必然會受到影響。由實驗結果可知，與NO組相比，鰱血清CK活力在HO組和AO組顯著升高，這與區又君等[14]對卵形鯧鲹的研究結果一致，表明低氧脅迫可能造成了鰱心肌損傷。魚類對不利環境有一定的適應性，面對低氧脅迫也是如此，魚體抗氧化系統會根據環境調控自身的生理以維持生存[15]。低氧脅迫實驗組中，HO組與AO組比較，血清CK活力差異不顯著，這可能是鰱對低氧脅迫環境具有一定的耐受性所致。但是，目前鰱的低氧耐受機制還不完全清楚。

3.2 低氧脅迫與細胞凋亡

經過漫長的生物進化后，鰱自身形成了一套精密的對抗低氧脅迫的機制，細胞凋亡是這套機制中的組成部分。魚類對低氧的耐受性取決于自身的生理調控能力，低氧可以引起細胞線粒體損傷，嚴重時導致細胞凋亡，缺氧超出閾值后則導致魚類死亡，相關研究認為低氧脅迫下，腦細胞和心肌細胞的大量凋亡是導致魚類死亡的主要原因[16]。心臟作為魚體的供氧中樞，對氧的需求很大，敏感度較高，低氧或缺氧后，必定會對其功能和器質完整產生影響。本研究采用TUNEL染色法對鰱心臟組織進行了形態學觀察，結果顯示，低氧脅迫加重了心肌細胞的凋亡現象，且隨著氧濃度的降低，凋亡細胞數目也在增加。此結果與吳鑫杰等[11]對團頭魴在低氧脅迫下心肌細胞凋亡的結果相同，與之有相似的結果在歐洲川鰈[17]、斑馬魚[18]上也有報道。趙金坤[8]研究了低氧脅迫下鰱腦細胞凋亡和肝細胞凋亡情況，結果顯示低氧脅迫處理至浮頭時，細胞凋亡數目顯著升高，但浮頭組與死亡組凋亡細胞數目差異不顯著，并認為造成此差異現象的原因之一可能是低氧脅迫誘導細胞凋亡存在一個閾值，當超出閾值后，細胞凋亡在細胞死亡現象中所占比不再增加，而是由其他死亡方式代替[19]。此外，筆者認為魚類由于在長期演化進程中會受到不同濃度溶氧水體的自然選擇，形成了適應不同溶氧水環境的物種，甚至近緣物種間或同一物種不同品系間對低氧脅迫的適應能力都不相同，因此，鰱不同器官或組織對缺氧的耐受性也可能存在差異[20]。但低氧脅迫下的細胞凋亡不僅表現為形態學和生理上的變化，諸如細胞核凝集、細胞膜皺縮、DNA降解、凋亡小體形成等，深層次的變化更是涉及多種信號通路的調控。

3.3 低氧脅迫誘導凋亡調控基因Bax、Bcl-2表達變化

細胞凋亡作為生命的基本現象之一，廣泛存在于多細胞生物的生命進程中。許多研究發現線粒體不僅為各種生命活動提供能量，在調控細胞凋亡中也具有中心調控作用[21]。線粒體凋亡通路表現為各種內外因素產生的胞內信號作用于Bcl-2蛋白家族改變線粒體膜的通透性，釋放促凋亡物質，如細胞色素C(cyt C)、凋亡誘導因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活蛋白(Smac/DIABLO)等，直接或間接導致細胞凋亡。Bcl-2基因和Bax基因是線粒體凋亡通路Bcl-2蛋白家族中具有對立功能的基因，分別表達為抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。正常生理條件下，Bcl-2蛋白和Bax蛋白各自形成同源二聚體，其中Bcl-2蛋白主要存在于線粒體膜，Bax蛋白主要存在于細胞漿；當胞內產生凋亡信號(受到低氧脅迫)，Bax會易位至線粒體膜上與Bcl-2蛋白結合成更穩定的異源二聚體，抑制Bcl-2蛋白的抑凋亡作用。哺乳類研究表明，細胞Bcl-2基因高表達時，Bcl-2蛋白和Bax蛋白異源二聚體大量生成，抑制Bax蛋白的促凋亡作用；細胞Bax基因表達升高時，Bcl-2蛋白和Bax蛋白形成異源二聚體，阻止了Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用[22]。因此，抗凋亡基因與促凋亡基因表達量的比值一定程度上決定了細胞的發展方向。本實驗研究結果顯示，隨著氧濃度降低至AO組水平，鰱心肌細胞Bcl-2基因表達量顯著性降低，Bax基因表達量顯著升高，Bcl-2/Bax的值也在逐漸減小，表明氧濃度降低至AO組水平時，細胞凋亡可能成為了鰱心肌細胞的主要發展方向，此結果與鱖魚[23]、團頭魴[24]、斑點叉尾鮰[25]等低氧脅迫下Bcl-2和Bax基因表達量的變化趨勢一致。但有研究表明，在慢性缺氧實驗中，鯉[26]、斑馬魚[18]、斑點叉尾鮰等部分抗凋亡基因表達量也會升高，如斑馬魚的BI1、bnip3基因，斑點叉尾鮰的blp1、mcl1α基因，這可能與魚類的自我保護機制有關，是不同魚類適應低氧環境所采取的生存策略。

綜上所述，低氧脅迫通過降低線粒體凋亡通路抗凋亡基因Bcl-2、升高促凋亡基因Bax，促使鰱心肌細胞凋亡，導致心肌損傷，隨著溶解氧濃度的降低，鰱心肌凋亡現象越顯著，心肌損傷越嚴重。細胞凋亡使存在于心肌細胞的CK釋放進入血液，導致血液中CK活力升高。因此，低氧誘導的心肌細胞凋亡導致心肌損傷可能是鰱在低氧脅迫下死亡的重要原因。

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