三株甲基營養型芽孢桿菌抑菌活性物質初探△

邵天蔚，張曉云，丁萬隆，王蓉，李勇*

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國科學院植物研究所，北京 100093）

人參Panax ginseng C.A.Mey.是五加科多年生宿根植物，我國傳統名貴中藥材。人參病害嚴重影響人參的產量和品質［1］，化學農藥長期不規范使用不僅造成自然生態環境嚴重破壞，同時也導致人參農藥殘留超標，給人參用藥安全帶來重大安全隱患［2］。生物防治是解決藥用中藥材病害防治及農殘問題的有效途徑之一，芽孢桿菌屬是目前研究較為成熟且應用較為廣泛的重要生防微生物［3-4］。根據已有研究報道，芽孢桿菌主要通過拮抗作用、競爭作用、溶菌作用、誘導抗性和植物促生長等［5］作用形式表現其生防作用。其中，芽孢桿菌合成具有抑菌活性的次生代謝物質，是抑制植物致病菌生長發育的關鍵［6］。前期，課題組從商品化微生物菌劑中分離了三株甲基營養型芽孢桿菌，通過對峙培養試驗證實了菌株對人參致病菌的抑菌效果，為上述菌劑在人參病害防治中的應用提供了理論依據。在此基礎上，本研究通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，研究了對峙培養過程中三株甲基營養型芽孢桿菌對人參銹腐菌Cylindrocarpon destructans、人參黑斑菌Alternaria panax、人參根腐菌Fusarium solan i和人參灰霉菌Botrytis cinerea菌絲生長的影響，并從菌株胞外分泌物中分離提取了粗脂肽、粗蛋白及有機溶劑萃取物，結合抑菌活性檢測，初步明確了三株芽孢桿菌的抑菌活性成分的有效部位。

1 材料

1.1 供試菌株

人參銹腐菌 C.destructans、人參黑斑菌A.panax、人參根腐菌 F.solani和人參灰霉菌B.cinerea以及甲基營養型芽孢桿菌 QM、BM2和HZ3均由本課題組保存。

1.2 供試培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L，pH 7。

LB培養基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，瓊脂10～15 g，蒸餾水1 L，pH 7。

1.3 主要儀器及試劑

電熱恒溫培養箱（DH6000，天津市泰斯特儀器有限公司）

恒溫培養振蕩器（ZHWY-100H，上海智城分析儀器制造有限公司）

超凈工作臺（YT-CJ-1D，北京亞泰克科隆儀器技術有限公司）

立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（LX-B35L型，合肥華泰醫療有限公司）

光學顯微鏡（Leica M205C，德國）

飛納臺式掃描電鏡（Phenom ProX，原產荷蘭）離心機（SIGMA，3K15，德國）旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）循環水真空泵（SHZ-mD，上海亞榮生化儀器廠）冷凍干燥機（2-4LD plus，德國Christ凍干機有限公司）

冷凍干燥機（LGJ-18，北京松源華興科技發展有限公司）

牛津杯（內徑8 mm，外徑9 mm）

血球計數板（0.05 mm×0.05 mm，上海市求精生化試劑儀器有限公司）

PBS緩沖溶液：KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，蒸餾水1 L，高溫滅菌后4℃保存

2 方法

2.1 對峙培養

將供試人參銹腐菌、人參黑斑菌、人參根腐菌和人參灰霉菌制成Φ6 mm菌餅，置于PDA平板中央，分別將拮抗菌株接種于距培養皿邊緣10mm處，25℃恒溫黑暗培養5～7 d。以只接種人參致病菌的平板作為空白對照。每個處理3次重復。

2.2 菌絲形態觀察

對峙培養5～7 d后，PDA平板上出現明顯的抑菌帶。用接種針挑取靠近拮抗菌株抑菌帶邊緣的致病菌菌絲于載玻片上，放置于樣品臺的導電膠上，靜置片刻后置于臺式掃描電鏡觀察盒內，觀察病菌菌絲的顯微形態。

2.3 發酵上清液的制備

挑取1環事先活化的芽孢桿菌菌株至100 mL的LB液體培養基中，35℃、150 r·min-1振蕩培養24 h作為種子液。按5%接種量將種子液接種到100 mL的LB液體培養基中，相同條件振蕩培養48 h，所得發酵液于4℃、10 000 r·min-1離心20 min，上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，得發酵上清液。

2.4 粗脂肽提取物的制備

取10 mL發酵上清液，用6 mol·L-1的HCl調節至pH2，4℃靜置過夜。4℃，10 000 r·min-1離心20 min。將上清液調節 pH7后即為酸化上清液，4℃保存，備用；所得沉淀用甲醇溶解，抽濾兩次，合并濾液，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，所得的干燥樣品用 PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經0.22μm微孔濾膜除菌，得脂肽粗提物。

2.5 有機溶劑萃取物

取10 mL發酵上清液3份，分別加入等量的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇，萃取兩次后合并有機相，揮干溶劑，用PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經0.22μm微孔濾膜除菌，得有機溶劑萃取物。

2.6 蛋白粗提液的制備

取10 mL發酵上清液，緩慢加入固體硫酸銨顆粒，使其飽和度分別達到40%、50%、60%、70%、80%和90%，4℃靜置過夜。4℃，10 000 r·min-1離心20 min，所得沉淀用0.02 mol·L-1的PBS緩沖溶液（pH 7.2）重懸至完全溶解，所得溶液裝入透析袋（截留分子量8～14 kD）中除鹽，直至1%的BaCl2溶液滴定透析外液無沉淀生成。將透析袋內溶液冷凍干燥，所得的干燥樣品用PBS緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）定容至10 mL，經0.22μm微孔濾膜除菌，得粗蛋白提取液。

2.7 抑菌活性檢測

在距PDA培養基中心2 cm處按需擺放牛津杯，每孔加入100μL待檢測溶液。將Φ6 mm人參根腐菌菌餅接種于平板中央，靜置過夜后，取下牛津杯，將PDA平板25℃倒置培養3～5 d后測量菌落半徑，根據抑菌率評價不同菌株的抑菌效果。

3 結果與分析

3.1 拮抗菌株對人參致病菌菌絲形態的影響

掃描電鏡觀察發現，對照組的人參根腐菌（圖2I）、人參銹腐菌（圖2II）、人參黑斑菌（圖2Ⅲ）和人參灰霉菌（圖2Ⅳ）生長正常，菌絲表面光滑，粗細均勻。

與QM對峙的人參根腐菌（圖2A）菌絲生長扭曲，且結成團塊，菌絲粗細不均，有破損現象，菌絲表面有凸起，不光滑；與QM對峙的人參銹腐菌（圖2B）菌絲生長扭曲畸形，菌絲中段膨大，部分菌絲末端膨大或扭曲導致不能正常延伸；與QM對峙的人參黑斑菌（圖2C）菌絲生長畸形，扭曲導致不能延伸，菌絲表面有瘤狀凸起，部分菌絲膨大；與QM對峙的人參灰霉菌（圖2D）菌絲生長畸形，表面有顆粒物或瘤狀凸起，菌絲斷裂和破裂嚴重，且纏繞成團狀。

圖1 拮抗菌株對人參致病菌菌絲生長形態的影響

與BM2對峙的人參根腐菌（圖2E）菌絲生長扭曲，在中部出現斷裂，部分菌絲膨大畸形，并且有瘤狀附著物；與BM2對峙的人參銹腐菌（圖2F）菌絲生長扭曲畸形，纏繞成團塊狀，部分菌絲膨大，末端不能延伸；與BM2對峙的人參黑斑菌（圖2G）菌絲生長扭曲畸形，末端膨大扭轉不能延伸，表面不規則凸起且有大量的顆粒狀物；與BM2對峙的人參灰霉菌（圖2H）菌絲生長畸形發生扭曲，纏繞成團，且斷裂嚴重，表面有少量顆粒狀凸起。

與HZ3對峙的人參根腐菌（圖2M）菌絲生長扭曲成團塊狀，團塊內部部分菌絲斷裂破損，部分菌絲膨大，有瘤狀凸起；與HZ3對峙的人參銹腐菌（圖2J）菌絲生長扭曲畸形，菌絲末端膨大導致延伸受阻，表面有大量的顆粒狀凸起；與HZ3對峙的人參黑斑菌（圖2K）菌絲生長粗細不均，纏繞成團，部分菌絲膨大、空泡化，末端尤為嚴重導致難以延伸，表面有瘤狀或顆粒狀凸起；與HZ3對峙的人參灰霉菌（圖2L）菌絲生長畸形發生扭曲、折疊和畸形，表面有顆粒狀或不規則的凸起。

圖2 發酵上清液的抑菌活性

3.2 抑菌活性檢測

對峙培養過程中，人參根腐菌生長明顯快于其他人參致病菌，故選擇該菌作為靶標菌用于的抑菌活性檢測。

3.2.1 發酵上清液的抑菌活性 實驗結果表明，菌株QM（圖2A）、BM2（圖2B）和菌株 HZ3（圖2C）發酵液對人參根腐菌生長有非常顯著的抑制作用。去除菌體后，菌株QM和BM2發酵上清液抑菌活性略有下降，說明發酵上清液中的抑菌活性成分對菌株的抑菌作用貢獻較大；菌株HZ3發酵上清液抑菌作用不明顯，說明發酵上清液中僅含少量抑菌活性成分。

3.2.2 粗脂肽的制備及其活性檢測 菌株發酵上清液酸化后產生明顯的絮狀沉淀，經甲醇溶解和超低溫真空冷凍干燥后得淡黃色脂肽粗提物。實驗結果表明，菌株QM（圖3A）、菌株BM2（圖3B）和菌株HZ3（圖3C）脂肽粗提物對人參根腐菌有明顯的抑菌效果，其抑菌效果與發酵上清液接近。三株菌的酸化上清液幾乎無抑菌效果。

圖3 脂肽粗提物的抑菌活性

用對峙培養法檢測脂肽粗提物對人參根腐菌的抑菌活性。研究發現，相同的檢測濃度下，菌株QM、BM2和 HZ3抑菌率分別為22.39±1.91%、25.83±1.03%和31.46±2.08%（表1）。

表1 脂肽粗提物對人參根腐菌生長的抑制作用

3.2.3 有機溶劑萃取物及其活性檢測 用三種不同極性有機溶劑提取菌株發酵上清液中的抑菌活性成分。實驗結果表明，菌株QM（圖4A）、BM2（圖4B）和菌株HZ3（圖4C）發酵上清液的石油醚與乙酸乙酯提取物無明顯抑菌活性。三株菌的發酵上清液的水飽和正丁醇提取液有抑菌活性，說明極性較大的水飽和正丁醇能夠提取有效活性物質。

3.2.4 蛋白粗提液的制備及其活性檢測 實驗結果表明，40%～90%不同飽和度硫酸銨鹽析出的粗蛋白均有一定的抑菌效果（圖5）。相同濃度的粗蛋白提取物的抑菌活性與硫酸銨飽和度存在相關性，菌株QM（圖5A，圖5B）、菌株HZ3（圖5E，圖5F）和菌株HZ3（圖5E，圖5F）的抑菌物質對人參根腐菌的抑制率隨硫酸銨飽和度的增加而提高，飽和度為70%時抑菌率達到最大值，之后隨硫酸銨飽和度增加，蛋白提取液的活性未發生明顯變化。

圖4 不同有機溶劑萃取液的抑菌活性檢驗

圖5 不同飽和度的硫酸銨沉淀的抑菌作用

4 討論

根據現有研究報道，芽孢桿菌的抑菌機制主要有寄生、競爭、抗生、溶菌作用和誘導抗病性等［7］。甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus是Madhaiyan等［8］于2010年從水稻根際土壤中分離獲得的，并確認其為芽孢桿菌屬的一個新種。研究發現，甲基營養型芽孢桿菌可產生抑菌脂肽、蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素等抑菌活性物質［9-10］。進一步研究發現，甲基營養型芽孢桿菌產生的抗菌蛋白對人參銹腐菌菌絲生長也有強烈的抑制作用，可以導致菌絲生長過程中分支增多、斷裂和菌絲空洞［11］。

本研究發現，三株供試甲基營養型芽孢桿菌與人參致病菌對峙培養時均產生明顯的抑菌帶，顯微觀察發現與甲基營養型芽孢桿菌對峙培養的人參致病菌表現為菌絲表面凹凸不平、膨大泡狀、斷裂破裂、扭曲纏繞等現象，推測3株芽孢桿菌產生了具有抗生及溶菌作用的抑菌活性物質［12-14］。

另外，本研究還發現，三株供試甲基營養型芽孢桿菌發酵上清液蛋白粗提物、脂肽粗提物以及有機溶劑提取物均有不同程度的抑菌活性，說明三株芽孢桿菌胞外分泌液中的抑菌活性成分并不單一，它們可能單獨發揮抑菌作用，也可能多種活性物質協同抑菌，這為揭示生防細菌的抗菌機理提供了參考依據。抑菌活性物質的生物學功能及其作用靶點還有待進一步研究。

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