精子DNA碎片指數與精液參數相關性的初步研究*

李非凡 楊 昊 肖佳云 王靈敏 黃 婭 王 羽 滕曉明

同濟大學附屬第一婦嬰保健院（上海 201204）

隨著輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）的發展，發現約有50%的不育由于男性生殖功能缺陷導致[1]。而男性不育原因有很多，如染色體異常、內分泌異常、精索靜脈曲張、繼發于感染或輸精管切除梗阻性不育等等。精液常規參數如精液量、精子濃度、pH值、前向運運精子百分率（PR,%）以及精子形態等評價精液質量有局限性，約有15%左右的男性不育患者精液常規分析為正常且各參數波動較大，已不能滿足臨床需要[2]。精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）反映了遺傳物質DNA的完整性或損傷程度，被認為是一個輔助評價精液質量的重要指標，尤其是在輔助生殖技術方面。本文對精子DFI和精液常規檢查參數的相關性進行研究。

資料與方法

選擇2016年1月至2016年12月在本院就診的3 020位男性作為研究對象。入選標準：身體健康，無睪丸外傷、腮腺炎、家族遺傳性疾病及性功能障礙病史，無不良生活嗜好（酗酒、吸煙等），男性檢查睪丸、附睪、輸精管等均無異常。精液檢查之前禁欲2～7d。排除標準：（1）嚴重少精子癥患者，即精子濃度＜2×106/mL；（2）精液檢查有白細胞精液癥的患者[3]；（3）手淫法取精過程中有遺漏者；（4）精液不液化及液化不良者。

一、采集方法

用手淫法收集精液并射入專用清潔的廣口塑料容器中，樣本放置37℃恒溫箱60min內待其完全液化利用計算機輔助精液分析系統獲取所需各項精液常規參數。同時將樣本分裝到1.5 ml的EP管中并放置于-20℃冰箱冷凍保存，在一周內立即借助流式細胞儀進行DFI分析檢測。

二、儀器與試劑

1. 精液常規分析：精子濃度、精子總活力、前向運動精子百分率、精子總數等通過西班牙SCA分析儀和日本Nikon顯微鏡進行分析。將10μL已經完全液化的精液加至以色列產精子計數板（Makler counting chamber，se fi-medical instruments）配合SCA進行分析，得到精子濃度、總活力、前向運動精子百分率等并記錄。

2. 精子DNA完整性檢測：采用浙江星博生物科技有限公司精子核完整性染色試劑盒（SCSA）試劑盒，產品標準編號：YZB/浙（甬）0159-2-12。標本制備：嚴格按照說明書操作。流式細胞儀檢測樣本：平衡樣品線后將已染好色的樣本加入樣品室，立即啟動樣品流；檢測精子的流動速度（流動速度應在100～300個/s，若速度過大，應重新稀釋樣本）；2min后開始收集數據，至少有5000個細胞的測定值加以記錄和統計；每個樣本至少連續檢測兩次。結果判讀：精子核經過酸處理液處理后，經吖啶橙染色，異常精子核染色質成單鏈與染料吖啶橙結合發橙黃色或紅色熒光；正常精子核染色質為雙鏈，與吖啶橙結合發綠色熒光，若紅光比值增高，說明精子核完整性程度降低。如圖1，DFI正常散點在綠色熒光區域較為集中，圖2分散為DFI異常。

圖1 DFI正常

三、統計學分析

統計學處理采用SPSS20.0軟件包，相關性分析使用雙變量并用Pearson分別進行分析。P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

圖2 DFI異常

結 果

一、DFI與精液參數的關系

本研究結果表明，DFI值與精子濃度不存在相關性（r =0.003，P＞0.05）。DFI值與精子總活力存在顯著負相關（r =-0.447，P＜0.01）；DFI值與前向運動精子百分率存在顯著負相關（r = -0.444，P＜0.01）。DFI值與精液量存在正相關（r =0.078，P＜0.01）；DFI值與精子總數存在正相關（r =0.069，P＜0.01），見表1。

表1 DFI與精液常規參數的相關性分析

討 論

特發性不育人群，一般認為存在精子功能異常或特定基因分子缺陷及生殖免疫異常等，DNA損傷會導致受精失敗，甚至影響受精卵、胚胎發育[4]。人類精子DNA是遺傳信息載體，其完整性程度決定遺傳物質能否正確傳遞給子代，精子染色質損傷影響精子的受精能力[6]。目前認為，導致精子DNA損傷主要有3個原因：精子染色質組裝異常，精子細胞的異常凋亡以及氧化應激反應[5,7]。在精子的逐漸成熟過程中，組蛋白為體積更小的富含精氨酸和半胱氨酸的魚精蛋白（HP）所取代，這一過程降低了精子本身對內外環境變化的修復能力，DNA雙鏈超螺旋折疊壓縮過程中產生的扭曲應力修復異常，導致精子DNA碎片化及染色質結構異常[8]。但魚精蛋白和二硫鍵共同作用使精子染色體高度濃縮從而更加緊密，成熟后的精子對內外環境變化抵抗力較強[9]。細胞凋亡是受基因調控的主動性生理性自殺行為，對動物個體的正常發育、自穩態的維持、免疫耐受等多種生理病理過程具有重要意義。人體細胞凋亡失調（包括不恰當的激活或抑制）會引發多種多方面疾病，精子DNA損傷包括其中。在生成精子較少的睪丸中，已經開始凋亡的生殖細胞終止凋亡，偏離正常程序，并進一步分化成成熟精子，會顯著增加精子DNA碎片。研究表明，空氣污染、吸煙都會導致精子DNA異常凋亡。機體過量生物活性氧類物質不再有助于精子獲能，開始導致精子DNA質膜完整性損傷以及DNA鏈的斷裂，從而損傷精子DNA。

許多方法已被開發應用于精子DNA完整性分析，如末端轉移酶介導的dUTP末端標記法（TUNEL）、精子染色質擴散實驗（SCD）和精子染色質結構分析（SCSA）等方法。本文檢測精子DNA碎片試劑盒所用為SCSA法，SCSA法快速、無偏差地通過流式細胞儀分析結合吖啶橙與單、雙鏈DNA結合后產生不同熒光而對精子DNA完整性進行評估，可以提供具有卓越精確度和重復性的強大統計數據，具有非常低的變異系數且操作方便，適合大量精子快速評估（～5000），可以進行批量檢測，滿足臨床需求。在常規實驗室操作中具有靈活性，可用冷凍標本[10,11]。

精子DNA完整性檢測在輔助診斷男性不育中的作用已越來越受重視。一般檢測結果中將精子DFI結果分為DFI≤15%、15%＜DFI≤30%、DFI＞30% 3組，DFI值越高，反映精子DNA完整性越差。本研究結果表明，精子濃度與DFI值不存在相關性，精子總活力、PR與DFI值存在顯著負相關，精液量與精子總數和DFI值存在顯著正相關。其中精子DFI與患者精子總活力、PR級精子百分率存在明顯的負相關，與孫靜波等[12]和麥選誠等[3]的研究相一致，即表明精子活力越好，DFI越低，其DNA完整性越好。而DFI與精子濃度無顯著相關性，與麥選誠等2016年得出研究結果一致[3]，而與此前曾蘭等得出的DFI與精子濃度呈負相關性結果不一致[2]。值得一提的是與此前研究[9,12]精子總數、精液量與DFI無顯著相關性不同，本次統計得出精子總數、精液量均和DFI呈顯著正相關，即是精子總數越高，DFI值越高，精子DNA完整性越差。其原因尚未清楚，推測可能受到禁欲天數影響，禁欲天數越長相對的精液量和精子總數就越多，精子核碎片增多，DFI增高。本設計作為一個初步的相關性分析，還存在一定不足，如未對禁欲天數進行分類統計比較。但就目前結果而言，精子DNA碎片指數與多項精液參數都存在顯著相關性，尤其是精子總活力和前向運動精子百分率。

結 論

我們通過研究精子DNA碎片指數與精液參數之間的關系，發現了精子DNA碎片指數與精子總活力、前向運動精子百分率負相關這個“表象”，至于是否有更深層次的機制聯系，有待進一步深入研究。而這些精液參數指標一定程度上可以為評價精子DNA完整性提供參考，可以為有需求卻暫時無法開展精子DNA碎片檢查項目的醫院提供參考。

1 黎智彪, 嚴共全, 黃莉, 等. 精子DNA碎片率與男性不育的關系研究. 中國醫藥科學 2016; 6(9): 128-130

2 曾蘭, 葉飛, 李運星, 等. 精子DNA完整性與精液常規參數相關性分析. 中國計劃生育和婦產科 2014; 6(4): 47-50

3 麥選誠, 董云華, 陳斌, 等. 不育患者精子DNA損傷和精液常規參數關系分析. 中國男科學雜志 2016; 30(4): 19-22

4 張艷萍, 張麗紅, 邱毅. 特發性男性不育癥患者精子功能檢測的臨床分析. 生殖與避孕 2015; 35(7): 489-493

5 Evenson D,Wixon R. Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay.Reprod Biomed Online 2006; 12(4): 466-472

6 Osman A, Alsomait H, Seshadri S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015; 30(2): 120-127

7 Gomes M, Goncalves A, Rocha E, et al. Effect of in vitro exposure to lead chloride on semen quality and sperm DNA fragmentation. Zygote 2015; 23(3): 384-393

8 陳亮, 徐陽. 精子DNA碎片化檢測在男性生殖領域的臨床應用. 中國男科學雜志 2014; 28(7): 60-62

9 秦文松, 劉英, 段金良. 精子DNA碎片指數與精液參數的相關性研究. 中國性科學 2014; 23(4): 55-57

10 Evgeni E, Charalabopoulos K, Asimakopoulos B. Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters. J Reprod Infertil 2014;15(1): 2-14

11 Donald P. Evenson. The sperm chromatin structure assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci 2016; 169(6): 56-75

12 孫靜波, 姜宏, 何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數的相關性研究. 中國男科學雜志 2010; 24(4): 26-29