溫通針法對過敏性鼻炎模型大鼠鼻黏膜形態學和IL-4影響的實驗研究?

田永萍，鄭先麗Δ，雒海燕，趙耀東，劉翔毅，姜 影，馬承旭，王明娟，劉 敏

(1. 甘肅中醫藥大學附屬醫院，蘭州 730000； 2. 甘肅中醫藥大學，蘭州 730000)

過敏性鼻炎是一種常年發病、無季節性的慢性鼻黏膜炎癥疾病，以打噴嚏、水樣清涕、鼻塞為主要特征[1],主要因特異性個體接觸變應原后由IgE介導釋放炎性介質、由免疫活性細胞、細胞因子及炎性介質等參與的鼻部變態反應性疾病。過敏性鼻炎的經典發病機制是在過敏原的刺激下經過反應形成T細胞，初始T細胞可在IL-4存在下分化為2型輔助性T細胞，經過抗體類別轉換導致IgE類抗體的產生，與特異性(specificIgE,sIgE)鼻黏膜中肥大細胞表面的IgEc受體(FcεRI)結合，從而使機體處于致敏狀態，一般在機體再次接觸相同變應原6～9 h達到高峰，然后逐漸消退[2]。在此期間，肥大細胞和活化的T細胞持續釋放活性遞質，促使輔助性T細胞2(helper T cell 2,Th2)、嗜堿粒細胞尤其是嗜酸粒細胞向鼻黏膜組織遷移、黏附、定位，鼻黏膜組織發生病理改變，導致遲發反應的癥狀[3]。本文從過敏性鼻炎發病機制出發，觀察過敏性鼻炎模型大鼠IL-4表達和鼻黏膜組織細胞的變化以驗證溫通針法對過敏性鼻炎的療效，旨在進一步發現溫通針法治療機制并提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.1.1 實驗動物 健康SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量150±20 g，購自甘肅中醫藥大學SPF實驗中心(實驗動物質量合格證號SCXK(甘)2011-0001)。

1.1.2 試劑及藥物 卵清白蛋白，Sigma公司，10 g/瓶(批號709B051)；氫氧化鋁，美侖生物，500 g/瓶(批號21645-51-2)；生理鹽水，四川科倫藥業股份有限公司，500 ml/瓶(批號H62020318)；ELISA試劑盒，欣博盛生物(批號R160318-002a)；丙酸氟替卡松，葛蘭素史克公司，125μg/瓶(批號H20130190)。

1.1.3 主要儀器 精密電子天平(OHAUS公司)；10～1000 μL微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)；酶聯免疫檢測儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號RT-6100)；高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司，型號TDZ4-WS)；微量振蕩器(姜堰市新康醫療器械有限公司，型號XK96-3)；電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司，型號101-2)。

1.2 過敏性鼻炎大鼠模型的建立

1.2.1 基礎致敏實驗 卵清白蛋白混懸液制備：每只大鼠稱取卵清白蛋白0.3 mg，氫氧化鋁15 mg混于1 ml生理鹽水中。30只大鼠稱取9 mg卵清白蛋白和450 mg氫氧化鋁后將其溶和于30 ml生理鹽水中，混勻備用；基礎致敏試驗造模[4]：將40只Wistar大鼠按照隨機原則分為空白對照組、模型組、藥物治療組、溫通針法組4組各10只，除空白對照組給予生理鹽水外，其余各組均給予卵清白蛋白混懸溶液腹腔注射1 ml/只，隔日1次，共7次。

1.2.2 過敏性鼻炎模型 卵清白蛋白溶液配制：用卵清蛋白和生理鹽水配置濃度為2%的卵清蛋白混懸液，每只大鼠雙側鼻孔需滴入0.1 ml，所以30只大鼠稱取60 mg卵清蛋白，然后將其溶于3 ml生理鹽水，混勻備用；局部激發造模實驗[5]：在致敏試驗基礎上，按照原有分組使用50 μL移液槍吸取0.1 ml溶液，對除空白組之外的其他3組大鼠雙側鼻孔進行滴鼻，每側0.05 ml，每日1次，連續7 d?？瞻捉M大鼠給予生理鹽水滴鼻，方法與劑量同模型組。

1.3 模型成功判定標準[6]

通過激發實驗，模型大鼠會出現打噴嚏、撓鼻、抓臉和鼻溢等癥狀。在給藥后30 min內對上述癥狀建立評分系統：鼻癢：輕度為1 分，輕擦鼻幾次；重度為2分，抓撓鼻、面不止，到處摩擦；噴嚏：1～3 個為1分，4～10 個為2分，11 個以上為3分；清涕：流到鼻前孔為1分，過鼻前孔為2分，流涕滿面為3分。以疊加法記錄總分，總分超過5分即為建模成功。

1.4 干預治療

1.4.1 藥物治療 藥物組大鼠每天給予丙酸氟替卡松噴鼻50 μL/次/側，每天1次，連續治療10 d。

1.4.2 針刺治療 根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》，選取“風池”(寰椎翼前緣直上方凹陷中，向后下方斜刺)“印堂”(兩眼眶上緣中點連線與正中線交點，向鼻根部平刺)“迎香”(鼻孔外側上端，有毛與無毛交界處，向下斜刺)，常規消毒后左手食指或拇指緊按針穴，右手持0.35×12 mm的毫針刺入穴內3 mm深，候氣至，左手加重力量，右手拇指向前連續捻按9次，針下沉緊后針尖拉著感應的部位連續重插輕提9次，拇指再向前連續捻按9次，針尖頂著有感應的部位推弩守氣使針下繼續沉緊，每穴操作60 s，然后慢慢將針拔去，按壓針孔，每日1次，連續治療10 d。

1.5 觀察方法

干預10 d后，第11天將大鼠用水合氯醛麻醉后心臟負壓采血，離心收集血清后保存，用ELISA法檢測血清IL-4表達，具體步驟參照試劑盒說明。大鼠采血后脫頸處死，將大鼠鼻腔打開后取下鼻黏膜組織，用10%甲醛固定后保存，石蠟包埋固定，病理切片后進行常規HE染色，在高倍顯微鏡下觀察組織炎性物質浸潤情況。

1.6 統計學方法

圖1 各組模型大鼠鼻黏膜組織病理切片HE染色結果(×400)

2 結果

2.1 溫通針法對模型大鼠鼻黏膜形態學影響

圖1顯示，光鏡下病理形態學發生改變，空白組黏膜上皮細胞完整且無破壞，組織未見炎性細胞浸潤和其他異常(見圖1 A)。模型組可見炎性細胞浸潤，主要是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，鼻黏膜上皮細胞破壞且邊緣不清，組織血管水腫擴張(見圖1B)。藥物組黏膜上皮組織基本完整，血管有腫脹、水腫，可見嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤，但較模型組減少(見圖1C)。溫針組黏膜上皮組織完整，可見少量嗜酸性粒細胞，基本接近正常黏膜(見圖1D)。

2.2 溫通針法對模型大鼠IL-4表達的影響

表1顯示，模型組大鼠血清中IL-4表達增加，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)。治療干預后，與模型組比較藥物組、溫通針法組大鼠血清IL-4含量降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與藥物組比較，溫通針法組大鼠血清IL-4含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。提示西藥和溫通針法均可以降低模型大鼠血清中IL-4的表達，但溫通針法的療效優于藥物。

表1 各組大鼠血清IL-4表達水平影響

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：▲▲P<0.01；與藥物組比較：△P<0.05

3 討論

過敏性鼻炎患者其鼻黏膜下組織中含有大量的嗜酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞及多形核白細胞，均可產生IL-4來導致過敏性鼻炎患者IL-4明顯高于正常人，所以過敏性鼻炎的發病機制與IL-4表達密切相關。而IL-4可誘導和促進IgE產生，故IL-4是調節IgE產生的重要因素。IL-4是激活淋巴細胞使其表達IgE的重要因子之一，它能導致大量IgE與肥大細胞表達的IgE受體結合，激活肥大細胞脫顆粒，釋放一切與炎癥有關的介質，從而引起黏膜水腫、黏液分泌增加[7]。由于這些特性，IL-4一直被認為是過敏性疾病和哮喘的潛在靶物。研究顯示[8]，過敏性鼻炎中巨嗜細胞移動抑制因子存在于炎癥位點的嗜酸性細胞中，嗜酸性粒細胞在體內外均能產生促炎癥細胞因子，過敏性鼻炎患者的嗜酸性粒細胞能釋放IL-4等多種細胞因子，從而介導白細胞的趨化和激活、纖維母細胞的增生和細胞外基質的形成，誘導血管內皮細胞上黏附分子受體的表達，從而激發過敏性反應。基于以上機制，本研究通過觀察過敏性鼻炎致炎因子IL-4的表達情況和釋放其組織炎癥細胞為出發點，來驗證傳統溫針治療手法對過敏性鼻炎的治療效果并探討其機制。

已有研究證明[9]，鼻黏膜形態學改變可以用來研究治療過敏性鼻炎的療效且有客觀性。因此本研究通過形態學證實，溫通針法對過敏性鼻炎模型大鼠鼻黏膜形態學的療效具有科學性和客觀性。通過研究結果顯示，筆者認為溫通針法可以抑制嗜酸性粒細胞在鼻黏膜聚集，阻止肥大細胞脫顆粒釋放炎癥介質，從而促進黏膜修復，治療過敏性鼻炎效果較好。

本研究所用溫通針法是在鄭魁山燒山火的基礎上通過溫熱手法針刺穴位而來[10]，從而達到提升機體陽氣、增強免疫的治病目的。相關文獻也曾表明，使用溫通針法后可以增強局部的免疫防御功能，改善鼻部的局部微循環，同時具有消炎鎮痛的作用[11]。因此筆者認為，溫通針法通過免疫調節機制對AR有著良好的治療效果和臨床推廣前景。

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[4] 胡艷菲.過敏性鼻炎動物模型研究進展[J].醫學研究生學報,2012,25(5):540-543.

[5] 成娜莎.地塞米松對實驗性過敏性鼻炎小鼠血清和鼻中隔黏膜TGF-β表達的影響[D].太原：山西醫科大學,2010:1-27.

[6] 溫立婷,陳福權,王潔,等.變應性鼻炎模型小鼠鼻黏膜的形態學觀察[J].現代生物醫學進展,2014,14(22):4210-4214.

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[8] 禹華瑋,徐大韜,李筱勇.變應性鼻炎患者鼻黏膜分泌物嗜酸性粒細胞觀察[J].華北煤炭醫學院學報,2005,7(6):703-704.

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