離子色譜法測定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖和維生素C的含量

豐 航，陳德妙，李 榮，單 敏

(1.陜西省人民醫院藥學部，西安 710068；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054)

鹽酸氨基葡萄糖(分子式 C6H13NO5·HCl)是甲殼素降解后生成的一種還原糖，又稱D-葡萄糖胺鹽酸鹽(D-glucosamine hydrochloride，GAH)，是存在于機體內尤其是關節軟骨中的氨基單糖，可刺激軟骨細胞產生正常多聚體結構的蛋白多糖，對骨性關節炎具有很好的療效[1-2]，現廣泛應用于葡維氨糖膠囊中；維生素C是人體必需的營養元素，具有抗氧化、強身健腦、促進骨膠原生物合成等功效，葡維氨糖膠囊中將二者結合用作增強關節免疫能力、促進軟骨創傷的愈合。目前，常用的鹽酸氨基葡萄糖含量檢測方法主要有HPLC法[3-9]、紫外-可見分光光度法[10-11]和液質聯用法[12]；而維生素C常用的檢測方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測器法[13-20]。尚未見同時檢測該2種成分的文獻報道。本文將利用鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的電導性質，采用離子色譜對其進行分離，借助電導檢測器同時進行二者的含量測定。該法操作簡單、靈敏度高、專屬性強、準確度和重復性良好，可為該產品的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ICS-3000離子色譜儀(美國戴安公司)，配有電導檢測器。

1.2試藥 鹽酸氨基葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號140649-201304，質量分數100%)，抗壞血酸對照品(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號111706，質量分數98.9% )；水為超純水；葡維氨糖膠囊(威海康寶生物科技有限公司，批號541016406)。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 分別精密稱取100 mg鹽酸氨基葡萄糖對照品和100 mg抗壞血酸(即維生素C)對照品，分別置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作為對照品儲備液。精密吸取該溶液各25 mL混合，用水稀釋成質量濃度分別為50，100，200，300，400和500 μg·mL-1的溶液，作為混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液 取適量膠囊內容物，用研缽研細，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3陰性樣品溶液 取適量不含鹽酸氨基葡萄糖和維生素C的陰性樣品，用研缽研細，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經0.45 μm濾膜過濾，作為陰性樣品溶液。

2.1.4溶劑空白溶液 取100 mL水，經0.45 μm濾膜過濾，作為溶劑空白溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Ion Pac AS-19(250 mm×4 mm)；保護柱：Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)；淋洗液：10 mmol·L-1氫氧化鉀溶液(在線淋洗液發生器生成)；抑制電流：25 mA；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測器：電導檢測器；進樣量：25 μL。色譜圖見圖1。

圖1離子色譜圖

A.對照品溶液；b.供試品溶液；c.陰性樣品溶液；d.溶劑空白溶液；1.維生素C；2.鹽酸氨基葡萄糖。

Fig.1 Ion chromatograms

A.reference substances solution;b.sample solution;c.negative solution;d.solvent blank solution；1.vitamin C；2.glucosamine hydrochloride.

2.3測定法 分別取2.1項下制備的對照品溶液和供試品溶液適量，按照2.2項下色譜條件進樣分析，根據保留時間定性，標準曲線法定量。

2.4線性關系考察 取2.1.1項下不同質量濃度的對照品溶液，分別進樣25 μL，以對照品溶液質量濃度為橫坐標(x)、色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，得鹽酸氨基葡萄糖回歸方程為y=0.039 4x-0.286 2，r=0.999 9；維生素C的回歸方程為y=0.037 4x-0.242 7，r=0.999 9。結果表明，鹽酸氨基葡萄糖與維生素C質量濃度在50～500 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5精密度考察 取質量濃度為300 μg·mL-1的混合對照品溶液連續進樣5次，每次25 μL，記錄峰面積及保留時間。鹽酸氨基葡萄糖與維生素C 峰面積的RSD值分別為0.33%和0.35%，保留時間RSD值分別為0.12%和0.17%，結果表明，二者精密度均良好。

2.6重復性考察 取同一批號供試品，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照2.2項下方法進樣測定，6份樣品鹽酸氨基葡萄糖與維生素C含量的RSD 值分別為1.12%和1.25%，結果表明，重復性均良好。

2.7穩定性考察 取已經制備好的供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，18和24 h進樣，記錄鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的峰面積,計算得RSD值分別為1.85%和2.57%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8回收率考察 精密稱取已測含量的葡維氨糖膠囊9份，各25 mg(分為3個水平，每個水平3平行)，分別置于100 mL量瓶中。3個水平分別精密加入鹽酸氨基葡萄糖對照品儲備液(質量濃度為1.008 mg·mL-1)各13.5，17.0和20 mL以及維生素C對照品儲備液(質量濃度為1.004 mg·mL-1)各1.0，1.3和1.6 mL，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經0.45 μm濾膜過濾，作為回收率實驗待測溶液。經計算，鹽酸氨基葡萄糖平均回收率為98.91%，RSD值為0.62%；維生素C平均回收率為98.46%，RSD值為0.88%。見表1～2。

表1鹽酸氨基葡萄糖回收率實驗結果

Tab.1 The results of glucosamine hydrochloride recovery test

序號加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%113.613.599.2698.910.62213.613.498.53313.613.498.53417.116.998.83517.116.998.83617.116.797.66720.220.199.50820.220.199.50920.220.199.50

表2維生素C回收率實驗結果

Tab.2 The results of vitamin C recovery test

序號加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%11.001.01101.0099.460.8821.001.00100.0031.001.00100.0041.311.3099.2451.311.31100.0061.311.3099.2471.611.5998.7681.611.5998.7691.611.5898.14

2.9檢測限和定量限 取2.1.1項下制備的混合對照品儲備液，用水稀釋制成不同質量濃度的溶液，按照2.2項下色譜條件進行測定，按照S/N≥3計算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測質量濃度均為0.1 μg·mL-1；維生素C的最低檢測質量濃度均為0.2 μg·mL-1；按照S/N≥10計算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測質量濃度為0.3 μg·mL-1；維生素C的最低檢測質量濃度為0.6 μg·mL-1。

2.10供試品測定 按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別測定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的含量。結果顯示，葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量為238.0 mg·粒-1；維生素C的含量為18.23 mg·粒-1。

3 討論

3.1檢測方法的選擇 鹽酸氨基葡萄糖的常用含量檢測方法主要有HPLC法、紫外-可見分光光度法和液質聯用法。由于該化合物在紫外區缺乏特征吸收，故在利用HPLC法時，只能采用紫外檢測器(紫外末端吸收法或柱前衍生法)或蒸發管檢測器進行測定。采用紫外末端吸收法靈敏度較低；蒸發光檢測器法雜質干擾大；而柱前衍生法操作繁瑣。利用紫外-可見分光光度法對復雜樣品進行測定時，選擇性很難達到要求。液質聯用技術在儀器方面成本投入過大，不利于推廣。維生素C目前常用的檢測方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測器法，比色法和熒光法對于復雜化合物的測定選擇性較差；采用高效液相色譜-紫外檢測器法則很難與測定鹽酸氨基葡萄糖相兼容。但鹽酸氨基葡萄糖與維生素C均為水溶性化合物，具有導電性。利用這2種化合物的這一性質，本文選用離子色譜法-電導檢測器對其進行分離、測定。

3.2離子色譜柱的選擇 鹽酸氨基葡萄糖與維生素C在其水溶液中均呈陰離子，帶有負電荷。故采用Ion Pac AS-19陰離子交換柱(250 mm×4 mm)即可實現對該陰離子的分離。由于樣品處理方法較為簡單，僅為加水超聲溶解，故在分離柱前增加同型號的預柱Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)進行柱保護。

3.3國標液相方法與本法比較 現行的鹽酸氨基葡萄糖測定方法為GB/T 20365-2006，該法中針對鹽酸氨基葡萄糖采用HPLC法，選用C18柱為分離柱，192 nm為檢測波長。由于該化合物的極性較大，在C18柱上很難保留，在2.5 min內即出峰。過早的出峰，除了與溶劑峰保留時間接近外，和樣品中雜質峰難以分開，干擾過大。此外，195 nm為紫外檢測器的末端吸收，在該波長下檢測對流動相試劑要求很高，檢測時流動相對結果影響很大。本法利用該化合物的電導性，選用陰離子色譜柱作為分離柱，用電導檢測器進行檢測。該法靈敏度高，鹽酸氨基葡萄糖最低檢測質量濃度為0.1 mg·mL-1,維生素C質量濃度為0.2 μg·mL-1,準確度和重復性均良好，可為國家制定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的檢測標準提供技術支持和參考依據。

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