二氫丹參酮Ⅰ對白血病THP1細胞的增殖抑制作用及其機制探討

李 慧，何 瑩，王慧潔，向 洪，王春森(.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院血液科，四川 成都 6007；.川北醫(yī)學院，四川 南充 67000；.四川大學華西藥學院&靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點實驗室，四川 成都 6004)

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一組起源于骨髓造血干細胞的高度異質(zhì)性的惡性腫瘤。盡管對于AML的治療已取得了長足進步，但目前臨床上對于復發(fā)和難治的AML尚無統(tǒng)一的治療方案，探尋新的治療藥物與作用靶點仍是該領域的研究熱點。二氫丹參酮I(dihydrotanshinone I，DTA I)是中藥丹參中的脂溶性有效成分，為具有鄰醌結構的二萜醌類化合物。研究表明，丹參酮類化合物對K562、NB4、U266等血液腫瘤細胞具有增殖抑制作用，其中尤以DTA I的藥效最強[1～3]。然而，DTA I對于急性髓細胞白血病THP1細胞的研究尚未見報道。據(jù)此，本文以THP1細胞為模型，考察DTA I對其的增殖抑制作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1試劑、試藥與細胞注射用鹽酸柔紅霉素(美國Pfizer公司)；DTA I對照品(成都蔓斯特生物科技有限公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學研究所)；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展公司)；PI/碘化丙啶(美國Sigma公司)；兔抗人Phospho-NF-κB p65、p38-MAPK、Phospho-PI3K p85、兔抗人二抗、鼠抗人二抗(均購自美國CST公司)。THP1細胞(四川大學華西臨床醫(yī)學院干細胞研究室惠贈)。

1.2細胞生長抑制率測定收集對數(shù)生長期的THP1細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，下同)稀釋至密度為2.5×105/ml；DTA I用DMSO溶解，以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。給藥組加入DTA I，濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、30 μmol/L；陽性對照組加入鹽酸柔紅霉素，使終濃度分別為0.7、1.4、2.8、5.6、11.2、16.8 μmol/L；另設置相應濃度的DMSO溶媒組、空白對照細胞組。每組設3個復孔，實驗重復3次。各組藥物(溶媒)與細胞共培養(yǎng)24、48、72 h后，采用CCK8法檢測細胞活性，計算其抑制率。

1.3細胞凋亡與周期檢測收集處于對數(shù)生長期的細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至密度為2.5×105/ml，加入DTA I，使含藥濃度為20 μmol/L；另設空白對照組。每組設3個復孔，實驗重復3次。共培養(yǎng)24 h后，1000 r/min×5 min離心，收集沉淀，用PBS洗滌2次，加入2 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光反應15 min；加入2 μl碘化丙啶(PI)，混勻，室溫避光反應5 min，進樣流式細胞儀，檢測細胞凋亡，采用FlowJo7.6軟件分析結果。另取上述藥物處理后細胞，1200 r/min×5 min離心，收集沉淀，用PBS洗滌2次，棄去上清液，加入2μl PI混勻，于37 ℃水浴保溫30 min，進樣流式細胞儀，檢測細胞周期，采用MODFIT 2軟件分析結果。

1.4Westernblot法檢測蛋白表達THP1細胞分別給藥不同濃度(1.25、2.5、5、10 μmol/L)DTA I24 h后，收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞，離心取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆茫珺radford法蛋白定量。配制分離膠(8%)和積層膠(4.5%)后上樣，垂直電泳分離。先穩(wěn)壓80 V 30 min，再調(diào)至110 V 60 min；取凝膠電轉至PVDF膜上。含5%脫脂奶粉的緩沖液封閉，加入NF-κB、PI3K及MAPK一抗4 ℃孵育過夜，分別加入相應二抗室溫封閉1 h，ECL顯色曝光成像。采用Quantity One 軟件處理圖像，以β-actin為內(nèi)參，進行半定量分析，蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參β-actin電泳條帶灰度值積分比值表示。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1DTAI對THP1細胞的增殖抑制作用由表1可見，與空白對照組相比，DTA I對THP1細胞的增殖抑制效應呈明顯的時間、劑量依賴關系。藥物與細胞共培養(yǎng)24 h，隨著DTA I濃度的增加，其對THP1細胞的增殖抑制率逐漸增加；DTA I濃度為5 μmol/L時，其在24、48、72 h的抑制率分別為69.3%、93.4%、95.2%。以細胞增殖抑制率(Y)為縱坐標，藥物濃度(X)為橫坐標作圖，計算得DTA I分別與THP1細胞共培養(yǎng)24、48、72 h，其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為 6.2、4.3、4.1 μmol/L。陽性對照藥物柔紅霉素在該實驗中也表現(xiàn)出相同的作用趨勢，其對THP1細胞的增殖抑制作用略強于DTA I。

表1 DTA I對THP1 細胞的增殖抑制作用

*與空白對照組比較，P<0.05

2.2DTAI對THP1細胞凋亡及細胞周期的影響由表2可見，THP1細胞與5 μmol/LDTA I共孵24 h后，與空白對照組相比，其早期細胞凋亡率為(6.1±0.54)% vs(1.3±0.11)%；晚期細胞凋亡率為(11.3±1.02)% vs(0.7±0.08)%(P< 0.01)，說明DTA I對THP1細胞的促凋亡作用顯著。與空白對照組相比，DTA I組處于G0/G1期細胞顯著增加，S期與G2/M期細胞顯著減少，表明DTA I可使THP1細胞周期停滯在G0/G1期。

表2 二氫丹參酮I對THP1細胞凋亡及細胞周期的影響

與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01

2.4DTAI對THP1細胞信號通路的影響由Western blot檢測結果(圖1)可知，與空白對照細胞組相比，THP1細胞與DTAI共孵24 h后，DTA I組NF-κB與PI3K兩條信號通路的蛋白表達均降低，且DTA I高濃度組(5、10 μmol/L)抑制作用更為顯著，但DTA I各濃度組對MAPK通路的蛋白表達均無顯著影響，提示DTA I可能通過下調(diào)NF-κB與PI3K信號通路途徑誘導THP1細胞凋亡。

圖1 不同濃度二氫丹參酮I對THP1細胞信號通路的影響1.空白對照細胞組；2.DTA I(1.25 μmol/L)；3.DTA I(2.5 μmol/L)；4.DTA I(5 μmol/L)；5.DTA I(10 μmol/L)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生常由多條細胞信號通路異常引起，常見的細胞信號通路是NF-κB、MAPK及PI3K。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)作為關鍵的信號傳遞分子在細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)基因的表達、腫瘤細胞的增殖及凋亡[1，2]。NF-κB是一種重要的轉錄因子，許多致癌因素可通過激活NF-κB途徑，促進細胞生長、惡性轉化及侵襲轉移等。某些藥物可通過抑制NF-κB活性從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、減少腫瘤血管生成等[3]。Han等研究發(fā)現(xiàn)通過抑制NF-κB信號通路，能有效促進白血病細胞的凋亡、分化[4]。PI3K 信號傳導通路異常活化同樣與腫瘤發(fā)生密切相關，在多種腫瘤中均有高表達[5]。異二聚體PI3K 是由調(diào)節(jié)亞單位 p85和催化亞單位 p110 組成，其通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，最終調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖分化與凋亡，其激活被認為是腫瘤細胞抗凋亡，導致對化療藥物的耐藥性的重要原因。許多血液性惡性腫瘤中存在 PI3K/Akt通路的持續(xù)激活，而 PI3K/Akt/mTOR 信號傳導通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡。例如丹參酮ⅡA誘導血液腫瘤細胞凋亡與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路有關[6]。另有文獻報道淫羊藿苷、姜黃素等通過激活PI3K/AKT信號通路來誘導白血病細胞分化及凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用[7，8]。

據(jù)文獻報道，DTA I可抑制血液腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，但其具體機制尚不十分清楚[9～11]。本文就DTA I對白血病THP1細胞的促凋亡作用及其對細胞周期的影響，NF-κB、MAPK及PI3K等信號通路的蛋白表達進行了檢測分析，以初步探討其抗腫瘤可能的作用機制。研究結果表明，DTA I對THP1細胞具有增殖抑制作用并呈濃度及時間依賴性，其可通過阻滯THP1細胞周期而促凋亡；其抗腫瘤作用機制可能與下調(diào)NF-κB、PI3K信號通路的蛋白表達有關。

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