血清樣本保存溫度和時間對胃泌素-17檢測結果的影響

麥 濤，唐義斌，王加強，張航烽，黃文芳(四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

胃泌素是由胃竇和十二指腸黏膜G細胞分泌的多肽類激素，其中約90%為胃泌素-17(G-17)[1]。研究表明，G-17能夠反映胃黏膜狀態，當胃黏膜發生病理變化時，血清 G-17含量也隨之發生改變[2，3]。因此，監測血清G-17水平可間接反映胃部黏膜的形態和功能，起到胃黏膜“血清學活檢”的作用，目前已被日本、芬蘭、挪威等國用于胃癌和癌前病變的篩查[4]。在我國，作為胃功體檢項目在各個醫療體檢單位得到推廣應用。但我國醫療資源配置分布不均，各醫療體檢單位所采集的胃功檢測樣本常需要送檢至第三方實驗室。由此導致各個樣本存在不同的運送時間、運送溫度等情況。而這些因素很可能給G-17的檢測工作帶來較大的分析前誤差。目前血中G-17在不同溫度及保存時間下穩定性的研究較少，有必要探討血清G-17標本最適保存條件。鑒于臨床工作對標本采集到整個檢測工作完成的時間要求一般在48小時內完成，2017年3～4月作者就48小時內G-17血清樣本保存時間和溫度對檢驗結果的影響進行分析并提出解決措施。

1 材料與方法

1.1樣本來源采取20名體檢者空腹10小時后血液樣本，室溫保存30分鐘待血清析出后，吸取并混合成一份樣本(以便消除個體潛在干擾因素的差異)，分裝，根據正交實驗設計，按不同溫度(4、25、37 ℃)和保存時間(血清析出后0.5、2、4、24、48 h)進行保存。

1.2儀器與試劑G-17檢測試劑盒(酶聯免疫法)購自芬蘭Biohit OYJ公司產品，使用艾迪康1100型全自動酶聯免疫分析儀，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3正交實驗設計根據臨床工作實踐及前期實驗，G-17檢測分析前誤差中，對實驗結果的影響較大的因素為樣本保存溫度、樣本保存時間，且兩者因素彼此之間可能存在交互影響。因此本實驗考察這兩個因素，每個因素各取三個水平，選用L9(34)正交實驗表設計正交實驗。以G-17測定值為觀察指標，每次實驗重復檢測2次。考察兩者不同實驗水平對G-17測定值的影響。鑒于考察的保存時間水平較多，充分利用正交實驗高效、經濟的優勢，根據保存時間設計2個不同正交實驗即短期保存正交實驗(表1)、長期保存正交實驗(表2)。

1.4血清凍存對G-17檢測的影響將15份體檢者空腹10小時的血液抽取，血清充分析出后，分成三份。將其中一份血清常規檢測G-17，余下的兩份血清分別凍存24、48 h后檢測。

表1 G-17短期保存正交實驗因素水平表

表2 G-17長期保存正交實驗因素水平表

1.5統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析。根據所得實驗數據，繪制血清G-17時間穩定性曲線。就血清凍存前后所得G-17定量結果進行單向方差分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1G-17不同溫度保存正交實驗結果分析將2項正交試驗所得G-17的測定值依次輸入各自的正交試驗表L9 (34)中，如表3、表4所示。計算出FA、FB和FA×B的F值，查F分布表得出F0.95(2，8)=4.46，F0.99(2，8) =8.65，F0.95(4，8)=3.84，F0.99(4，8)=7.01。方差分析結果如表5、表6所示。可知因素A、B對試驗結果的影響是高度顯著的；兩者對G-17的穩定性的影響存在顯著的交互作用，且A1×B1組合時測定值最高。SPSS 19.0統計分析所得的直觀效應圖(圖1)及G-17時間穩定曲線(圖2)顯示，隨樣本保存溫度的上升、保存時間的延長，G-17降解程度越大。所檢測的三種保存溫度(4、25和37 ℃)下，根據其各自回歸曲線方程式，可計算出G-17降解10%所需時間分別為約20、4、2.5 h。因此，檢測G-17的樣本最優保存方案是在4 ℃下保存，20 h內及時檢測。

表3 短期正交實驗結果

表4 長期保存正交實驗結果

表5 短期正交實驗結果方差分析

表6 長期正交實驗結果方差分析

2.2凍存前后G-17檢測結果比較不同凍存時間的G-17測定值與凍存前比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)，說明血清樣本凍存48 h內對檢測結果無影響。見表7。

表7 -20 ℃凍存前后G-17測定值

3 討論

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率在我國居于第2 位，在全球位列第5 位[5，6]。有研究顯示我國年齡在40周歲以上人群，胃癌的患病率明顯增高，因此推薦40歲以上人群參與胃癌篩查[7]。目前胃癌的篩查手段有很多種如影像學技術、胃鏡及內鏡下活組織病檢，但優缺參半。因此操作簡單、經濟、受檢者痛苦較小的胃功能血清標志物如胃泌素G-17、胃蛋白酶原的定量檢測成為早癌篩查或診斷的重點工作。其檢測有助于胃癌的篩查，對胃癌有較高的特異性[8]。在臨床免疫檢查中，胃泌素在胃部疾病中的應用與其血中檢測值緊密相關。2015年1月“中國早期胃癌篩查方案”上海國際研討會初步確定了胃鏡精查的血清學界值：PGⅠ≤70 μg/L，且PGⅠ/PGⅡ≤7.0，和G-17≤1 pmol/L，或G-17≥15 pmol/L，得到其他眾多專家的肯定。作者在臨床工作中發現地區健康人群空腹血清中G-17濃度呈負偏態分布，其中位數為2.629 pmol/L，四分位數間距為2.172 pmol/L。因此，如檢測誤差較大，很容易出現測值低于1 pmol/L或15 pmol/L這兩個閾值的情況，從而導致誤診。所以減少G-17檢測的分析前誤差，得到準確的實際值，對其應用非常重要。

作者根據實驗結果，繪制了在4、25和37 ℃三個最常用的臨床工作溫度下G-17時間穩定性曲線。實驗結果的統計分析以及所繪制的曲線顯示出，G-17在離體后即開始降解。其降解速度表現為大致的拋物線型。但其降解速度在不同的保存溫度下表現不一致，即表現出隨保存溫度的下降而降解加快的規律。臨床實驗檢測工作中，實驗誤差難以避免，方法學存在允許誤差范圍。Tonks就方法學的醫學效能限度，提出最大允許范圍為其均數CV10%。對G-17檢測而言，作者認為在血樣離體早期內，G-17雖存在降解，但降解至其實際值90%內，對萎縮性胃炎、胃癌等胃部疾病的篩查工作影響不大。該早期時段是臨床G-17檢測前的保存時長。我們的實驗結果顯示，該保存時長受離體血清保存溫度影響，表現出隨保存溫度的上升而縮短的規律。在4 ℃時，其保存時長為約20小時，而在25 ℃和37 ℃時，則分別縮短為4小時、2.5小時左右。這表明，在臨床工作中，對于待檢測的G-17標本必須盡快處理。如每個樣本血清析出后，放置于4 ℃環境下可保存20小時。否則根據所得出的G-17在不同溫度及保存時間的穩定性規律，勢必導致胃病篩查假陽性率增高。

在實際工作中，難免會存在無法及時檢測的情況，需要凍存血清樣本。對此，我們就-20 ℃保存標本較長時間是否會影響檢測結果進行了配對設計實驗，經過統計分析，兩者的檢測結果無顯著性差異。因此，對于因各種原因所致無法及時檢測時，可以保存于-20 ℃較長時間。以便盡量減小分析前誤差。如將標本外送至第三方醫學實驗室檢測，最好采用-20 ℃冷鏈運輸。

總之，根據G-17離體后時間穩定性曲線，采用低溫保存，盡快檢測或者-20 ℃凍存是較好的降低分析前誤差的措施。

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