乳品真菌污染及快速檢測技術研究進展

楊同香 常小靜 吳孔陽 費 鵬 陳俊亮 唐浩國 劉麗莉 康懷彬

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南三劍客農業股份有限公司,河南 漯河 462000；3. 洛陽師范學院生命科學學院，河南 洛陽 471934)

在食品加工和農業生產過程中，易受到真菌及其所產毒素危害，控制食品和飼料中霉菌和酵母菌數量仍然是一項重中之重的工作[1-2]。因此，盡早發現并確定微生物種類、數量、所產危害物質,監視以及抑制真菌生長等研究工作顯得尤為重要[3]。乳及乳制品在生產加工過程中，由于受到原料乳質量、加工工藝、加工環境條件、生產人員技術水平等因素影響，會發生微生物污染事件，另外產品在冷藏、運輸、銷售等環節也容易被微生物污染。盡管通過一些預防和控制方法，比如生產質量管理規范(GMP)以及技術改進等，微生物污染問題仍然是生產商們面臨的重要問題[4-5]。近年來，研究人員對乳及乳制品中常見食源性致病菌檢測技術開展了廣泛的研究，主要包括針對沙門氏菌[6]、蠟樣芽孢桿菌[7]、阪崎腸桿菌[8]、李斯特菌[9]和志賀氏菌[10]等病原菌，同時對其檢測技術進行了很好的歸納和分析[11-12]。針對乳及乳制品中常見真菌檢測技術方面研究概述則相對較少，而真菌對乳及乳制品的污染問題依然不能忽視，對其快速檢測技術開發一直以來也是相關研究人員關注的問題。因此，文章從乳及乳制品中常見的真菌類型、真菌污染概況、真菌檢測技術及污染的質量控制等方面進行概述。

1 乳品中真菌污染概況

全球乳產量持續增長，2016年估計為4.988 2×108t，消費群體分布在不同年齡段[13]。然而乳制品易受多種因素影響而引起污染，比如金屬、農藥和微生物等。在乳品終端銷售環節，因發現菌絲體污染引起的產品召回事件頻發[14]。從李雨哲等[15]對中國東北地區市售干酪中霉菌、酵母的情況調查中也可以發現，大約有20%的干酪存在霉菌或酵母超過現行標準(GB 5420—2010)要求的現象。Shokri等[16]通過對伊朗亞茲德省7個農場的70份駱駝奶樣進行分析，發現存在酵母、霉菌及黃曲霉毒素污染。其中鑒定的酵母主要包括假絲酵母屬(占比48.2%)、紅酵母屬(占比22.3%)、絲孢酵母屬(占比13.4%)，鑒定的霉菌主要是絲菌屬(占比16.1%)。另外對奶樣黃曲霉毒素檢驗分析，發現其中20份奶樣存在污染，黃曲霉毒素的平均含量達到45.95 ng/L，最低和最高含量分別為5.19，150.17 ng/L。

通過傳統平板分離培養和現代分子生物學技術的研究，發現受污染的乳及其制品中多源于酵母菌和絲狀真菌存在而引起產品變質[17-19]。Kalamaki等[20]通過分子鑒定研究發現開菲爾粒中酵母菌包括10個屬(Candidaspp.、Debaryomycesspp.、Galactomycesspp.、Issatchenkiaspp.、Kazachstaniaspp.、Kluyveromycesspp.、Pichiaspp.、Saccharomycesspp.、Wickerhamomycesspp.、Yarrowiaspp.)，酵母菌種類達14種。通過對各種動物乳、酸乳及奶酪中真菌的分離和鑒定，不難看出在乳品生產加工過程中，受酵母污染的乳品優勢酵母種主要包括：Debaryomyceshansenii、Kluyveromycesmarxianus、Rhodotorulamucilaginosa、Saccharomycescerevisiae等。盡管有些乳制品中酵母數量適度增加，通常不會引起食品安全問題，但是普遍認為其是引起食物腐敗的重要因素[21]。對于絲狀真菌污染情況的研究也發現眾多不同種屬真菌的存在。Lopandic等[22]通過隨機擴增多態性DNA-PCR技術(RAPD-PCR)對奶酪、黃油、酸奶、酸奶油等進行酵母菌的分離和鑒定研究，發現獲得的513個菌株中，460個屬于子囊菌酵母，53個屬于擔子菌酵母類。此外Buehler等[23]從原料奶、奶酪、酸奶等樣品中分離得到361株真菌，進而對其ITS進行DNA測序，并經BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索和UNITE數據庫(https://unite.ut.ee/analysis.php)比對分析，可將這些真菌劃分為3門19屬，占比最多的3個屬分別是青霉屬(25%)、德巴利酵母屬(18%)和念珠菌屬(9%)。Banjara等[24-25]研究同樣發現，在奶酪中德巴利酵母屬真菌所占比例最高，青霉屬真菌也普遍存在。

實際上，原料乳及其制品在奶樣采集、生產加工、貯藏、運輸和銷售等環節均可能出現真菌污染問題，比如在產品生產過程中，可能由于空氣、包裝材料、發酵劑、穩定劑等污染而引入真菌孢子進入酸奶中[14]。Kure等[26]為了找出引起挪威亞爾斯堡奶酪生產過程中霉菌污染的關鍵點，從不同的生產車間采集空氣、牛奶、鹽水、機器設備表面、塑料薄膜等樣品，通常引起奶酪污染的P.commune、P.palitans、P.solitum以及P.roquefortiss.Roqueforti等霉菌，可以在采集的空氣和機器設備表面樣品中發現。研究人員[26]認為通過控制并提高車間空氣質量，尤其是包裝車間，對于降低霉菌污染事件的發生非常重要。在埃及乳制品市場，奶酪占比最大，對于奶酪生產商來講，在奶酪貯藏期面臨最大的威脅是霉菌污染[27]。由于生產工藝差別，有些類型的酸奶更容易引起微生物污染，像希臘風味酸奶，以其高蛋白(蛋白含量達9%～10%)、低脂等著稱，通常比其他酸奶生產更復雜，因此在生產中也增加了微生物污染的風險[28]。當然還有研究人員[29]發現在溫度較高的季節，加之缺乏有效的冷藏手段，乳品發生污染的可能性通常會更大些。

2 真菌的快速檢測技術

通常情況下，由酵母菌污染引起的酸奶產品變質，主要可以通過產品外觀、滋味、氣味等進行初步判斷，比如出現脹袋、酒香味，嚴重時在產品表面可看到酵母的菌落[30]。目前對于乳品中真菌的檢測，傳統檢測手段是利用平板培養分離和鑒定的方法，檢測時間通常為5～7 d，具有滯后性，一般很難滿足實際生產的需要，且已有眾多相關研究[31-33]，本文不再贅述，著重就微生物快速檢測技術和分子生物學檢測技術進行介紹。

2.1 流式細胞儀快速分析法

在水果制品行業，對于酵母和霉菌污染的評測是一項關鍵的指標，由Chemunex開發的一款ChemFlow細胞儀計數系統可以快速對水果制品中的微生物污染情況進行評測[34]。利用該系統可以在24～48 h內實現對10 g水果制品中含有1個及以上酵母細胞的檢出水平，這也很適合用于水果風味酸奶樣品中酵母的檢測[35]。

2.2 微生物快速檢測系統

隨著微生物快速檢測系統的完善和發展，乳及其制品中酵母菌和霉菌的檢測手段也變得更加快捷。鄭東輝[36]利用WKJ-Ⅱ微生物快速檢測儀，該系統是基于計算機視覺技術檢測乳制品中的細菌總數、酵母菌和霉菌。在上機測試過程中，通過比色法和微濾富集快速檢測酸奶中酵母菌，通過微濾富集、涂片染色快速檢測酸奶中霉菌。原銓[37]利用美國BioLumix微生物熒光光電檢測系統對酸奶樣品檢測，可以將原先5～7 d的檢測時間縮短至48 h，該檢測系統通過染色技術監測霉菌和酵母菌代謝過程，將染色、新光源、光傳感器結合在一起的光電檢測系統。

2.3 分子生物學快速檢測技術

通過分子生物學技術檢測食品中的真菌，已經取得顯著成效，并廣泛應用于實際生產。目前主要有聚合酶鏈式反應技術(PCR)，并在此基礎上開發了不同的PCR技術，比如反轉錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR、單鏈構象多態性-PCR以及環介導等溫擴增技術(LAMP)等[38-40]。這些技術都體現出對特定基因以及特異性引物的選擇和設計，通過合理的試驗設計，可以很好地擴增出所需要的目標DNA，從而利用相關分析方法，判斷乳品中微生物菌群的數量和種類。

Vaitilingom等[38]利用RT-PCR擴增延伸因子(EF-Tu或者EF-1α)，實現了對巴氏殺菌奶中細菌、霉菌和酵母的檢測。在4 h內，輕易檢測出的細胞在10個/mL，另外還證實該方法可以用在酸奶、啤酒等產品中。Mayoral等[41]同樣利用RT-PCR技術成功地檢測出酸奶樣品中有活性的馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，利用該方法可以檢出酵母的下限為102CFU/mL。Mayoral等[30]還開發了一種利用PCR-培養技術檢測酸奶樣品活性的馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)方法，通過對污染酵母的酸奶樣品(不少于10 CFU/g)恒溫振蕩培養24 h，然后進行DNA提取，擴增18S rRNA，可以得到一個251 bp的特異性條帶，而未培養的對照酸奶樣品則檢測不到目標條帶。針對馬克思克魯維酵母，Kim等[39]報道了一種新穎的基于Taqman探針的熒光定量PCR技術，用于快速靈敏地檢測開菲爾酸奶發酵過程中該酵母的污染情況，通過試驗研究發現，利用該方法可以在2 h內檢測出開菲爾酸奶中的馬克思克魯維酵母。相比之下，根據美國FDA細菌學分析手冊所提供的標準培養方法用于檢測乳制品中酵母的污染，至少需要5～7 d的分離培養時間以及另外2～3 d的時間用于基于基因測序和生化分析鑒定酵母，Kim等[42]所做的研究工作在乳品工業上具有更好的應用價值。另外通過疊氮溴化丙錠(PMA)結合qPCR對乳制品樣品中活菌DNA進行定量也能快速檢測發酵乳中酵母菌。蓋冬雪[43]通過建立的PMA-qPCR方法與標準法(GB 19302—2010)檢測酵母菌比較發現，發酵乳中酵母菌PMA-qPCR活菌檢測結果與國標法符合率大于86.6%，檢測時間約為4 h，該方法作為檢測發酵乳中是否存在酵母菌的有力工具，適合乳品加工企業生產線的現場評價。

除此之外，Kasahara 等[44]建立了一種LAMP技術用于快速檢測乳品中致病酵母菌(C.albicans、C.glabrata、C.tropicalis、T.asahii、T.mucoides、C.parapsilosis)，結果表明該方法靈敏、省時、高效，可以作為一種監測食品質量的簡便快速方法。另外利用PCR技術還可以用于快速評估奶酪成熟過程中菌群的動態特征及比例，例如Callon等[45]借助單鏈構象多態性-PCR(SSCP-PCR)指紋圖譜分析奶酪中酵母菌群情況，主要是通過設計酵母特異性引物，擴增18S rRNA 的V4區達到SSCP分析的目的。

3 乳及乳制品中微生物污染的質量控制

隨著中國食品質量安全市場準入制度的建立，食品生產企業面臨著嚴峻考驗。對于很多生產企業來說，由于工藝裝備簡單，技術力量薄弱，控制微生物的污染成為工作的難點，其中溫度控制是非常重要的[46]。Ombarak等[27]研究發現可以通過那他霉素和山梨酸鉀的協同作用抑制霉菌的生長，從而延長奶酪的貯藏期。Ollé Resa等[47]研究則發現那他霉素對酵母菌也有很好的抑菌效果。此外，水活度是影響食品中真菌發育的非生物因素之一， Nguyen Van Long等[48]建立了基于氯化鈉或甘油減少水活度的模型，闡述其在奶酪中對絲狀真菌分生孢子萌發和徑向生長的影響效果，結果表明通過氯化鈉降低水活度能夠顯著起到抑制真菌效果。

4 展望

開發具有抗真菌活性的優良乳酸菌輔助發酵劑，不僅可以解決酸奶中霉菌和酵母菌污染的問題，還可以適當延長發酵乳制品貨架期，有望成為提高酸乳產品穩定性及品質的一把利劍[49-51]。而作為監測乳品生產過程中是否存在真菌污染的檢測技術，今后仍然有很多值得研究和探討的地方。由于各個乳品生產企業規模、效益、技術水平有較大差異。經濟實力雄厚的企業可以通過購置先進的微生物快速檢測系統用于真菌風險評估，而對于中小型乳企業而言，受資金、技術及人才等因素影響，更希望獲得簡單、快速、低廉的檢測方法。隨著分子生物學技術的不斷發展，利用熒光定量PCR可以很好地解決這一問題。今后可以進一步完善熒光定量PCR體系，比如篩選DNA結合試劑、開發其他引物用于檢測更多潛在的微生物[52]。

隨著新科學技術和工具的發展，比如全基因組測序技術將會給尚未認知的乳品微生物研究提供全新的視角，可以用來研究分析那些對產品質量或公眾健康有風險的微生物[53]。本課題組已著手開展乳品中真菌分子標記的開發，借助新的測序技術，探索一種快速檢測乳品真菌的方法，以期為乳品真菌污染檢測提供新的思路。