腺苷微生物發酵生產技術研究

腺苷是一種遍布人體細胞且具有重要生理功能的內源性嘌呤核苷，對心血管系統和肌體其它系統及組織均有生理作用。目前，腺苷的生產方法主要有RNA水解法、化學合成法和生物發酵法。日本早在70年代就開始了發酵法生產腺苷的研究，并取得了一系列成果，已進入大規模工業生產階段。國內發酵法生產腺苷的起步較晚，隨著腺苷的應用越來越廣泛，有必要對其進行更深入的研究。

目前，國內腺苷微生物發酵生產技術主要集中于研究菌種選育、發酵工藝。如中國專利CN200510063223.3公開了一種微生物發酵法生產腺苷的生產工藝，生產工藝為：用腺苷生產菌作為生產菌種，經過斜面菌種培養及種子罐擴大培養后，接入發酵罐進行發酵生產得到發酵液，發酵液通過無機膜過濾、濃縮、結晶、離心、重結晶、離心、干燥、粉碎整粒工序制得成品。CN200510055696.9提供了一種腺苷產生菌枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)JSIM-1025，還提供一種生產高產量腺苷的發酵方法，利用包括1.8%的最適濃度酵母膏的最佳培養基組分，最適pH6.5和40%的最適溶氧控制范圍的發酵條件，在37℃下發酵60 h后的產苷能穩定在23 g/L以上。CN201310301844.5公開了一種通過流加有機氮源提高腺苷發酵產量的方法。該方法以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL為生產菌株，通過在產苷階段補充氮源的補料策略實現了枯草芽孢桿菌XGL發酵生產腺嘌呤核苷的高產。該發明的方法優勢在于，在腺嘌呤核苷發酵生產的整個過程中，氮源的濃度不斷降低，發酵過程中流加氮源可以保持氮源的充足，在減少反饋抑制的同時，使腺嘌呤核苷的產量達到42.4 g/L，產量提高26%，發酵周期壓縮至50 h左右。CN201310097396.1公開了一種采用梯度pH順序控制發酵生產腺苷的方法。該方法以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL為生產菌株，以梯度pH的順序控制方式分批發酵生產腺苷，在菌體生長階段控制pH為6.7～7.0，在達到一定菌體量后控制pH為6.0～6.3，發酵60 h，腺苷產量為18.2 g/L。該方法可以提高腺苷的產量，發酵過程無需增加額外設備，適合于工業化生產。CN201310561917.4公開了一種膜生物反應器菌株誘變培養及腺苷發酵方法，其采用酶抑制劑利巴韋林、甲氨喋呤、別嘌呤和乙嘧酚磺酸脂協同誘變枯草芽胞桿菌，在膜生物反應器中高密度培養，經過一到兩次誘變得到產腺苷8 g/L，尿苷6 g/L的枯草芽胞桿菌菌株。劉劍（2012）對腺苷發酵過程中不同溶解氧濃度進行研究，通過對發酵終點丙酮酸的檢測，發現枯草芽孢桿菌在低溶氧狀態下比高溶氧狀態下積累更多的丙酮酸，在此基礎上，提出兩階段控制策略，最終腺苷積累量達到20.1 g/L，為腺苷工業生產提供理論參考。李金鑫（2015）以B.subtilis DI3-243為出發菌株,利用N+離子束注入和硫酸二乙酯(DES)為誘變劑進行單因子以及復合誘變處理,進行高產腺苷菌株的選育和發酵條件的優化等研究。從中篩選出產苷水平高且性狀穩定的菌株，其中的DI4-24R-37菌株產苷15.84 g/L，其回復突變率明顯下降。在500 L發酵罐放大試驗，發酵72 h產苷28.9 g/L。張命龍等（2016）通過搖瓶液體培養的方法，以菌絲體生物量為主要考察指標，篩選蝙蝠蛾擬青霉PH-2菌株液體發酵的培養基成分和條件。進一步采用正交試驗，以菌絲體生物量和腺苷含量為聯合指標，確定PH-2菌株液體發酵高產菌絲體和腺苷的培養基配方。通過試驗獲得的最佳配方為：玉米淀粉40 g/L，葡萄糖5 g/L，玉米漿25 g/L，硫酸鎂·7H2O 1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鋅1.5 g/L，維生素B125 mg/L；培養條件為：初始pH 6.0，裝液量150 mL/500 mL，接種量8%(V/V)，溫度26℃，轉速120 r/min,培養7 d。在該工藝下菌絲體生物量達到25.2 g/L。應用高效液相色譜(HPLC)法，檢測到菌絲體中腺苷質量分數為2.76 mg/g。

腺苷生物發酵法具有生產成本低、反應條件溫和、原料來源廣泛等優點，因此將會是今后生產的發展方向。針對現有腺苷生產菌生產水平低、副產物高的突出問題，研究人員應在代謝工程理論指導下，對腺苷的合成代謝網絡進行全面分析和研究，從中心代謝、支路代謝和能量代謝等多個角度對腺苷生產菌進行多途徑的協同修飾和調控，構建出生產能力更高的腺苷生產菌；并對腺苷生物合成途徑進行代謝流分析，以此為依據對發酵條件進行優化，確定最佳的發酵配方和控制條件。