響應(yīng)面分析法優(yōu)化菠蘿皮渣多糖提取工藝研究

趙巧麗，龐振才，張廣明，劉玉革，胡會剛

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091）

菠蘿（Ananas comosus），又名鳳梨、旺梨，是熱帶四大名果之一，具有解暑止渴、降壓利尿和消食止瀉等功效。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國熱帶地區(qū)菠蘿種植面積達(dá)6.7萬公頃，產(chǎn)量達(dá)144萬噸[1]。在菠蘿鮮食和加工過程中會產(chǎn)生大量皮渣，其重量約為全果的50%～60%，每年幾乎都被大量丟棄，不僅造成資源浪費，還加重了環(huán)境污染。有研究表明，菠蘿皮渣中總糖、水分和檸檬酸的比例與果肉相差無幾[1]，若對這部分廢棄物加以綜合利用，對于延長菠蘿產(chǎn)業(yè)鏈，指導(dǎo)其精深加工具有重要意義。

多糖是菠蘿皮渣的主要活性成分之一[2-6]，具有抗氧化[7-9]、抗脂質(zhì)過氧化[10]和抗腫瘤[11]作用，同時還可改善腸道內(nèi)環(huán)境[12]、抑制T和B淋巴細(xì)胞增殖[13]、增強(qiáng)斷奶豬仔的抗病能力[14]。近年來，有關(guān)菠蘿皮渣多糖的提取工藝已有一些報道，王詩標(biāo)等[15]研究用超聲波輔助提取菠蘿皮渣多糖并分析其抗氧化活性。羅建平[8]和郭巧玲等[12]研究用熱水提取菠蘿皮渣多糖，但提取時間較長，效率不高。目前，有關(guān)超聲波輔助熱水法提取菠蘿皮渣多糖的研究尚未見報道，基于此，本研究將超聲波輔助熱水提取技術(shù)應(yīng)用于菠蘿皮渣的提取，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗設(shè)計和Box-Behnken中心組合設(shè)計優(yōu)化提取工藝參數(shù)，旨在為菠蘿加工副產(chǎn)物的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

菠蘿皮渣：雷州市英利鎮(zhèn)紅土地菠蘿皮綜合利用廠。

無水葡萄糖：美國Sigma公司；濃硫酸：廉江市愛廉化試劑有限公司；苯酚：天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHG 9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo公司；RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫公司；UV-2550型紫外分光光度計：日本島津公司；PS-30ALD超聲波清洗儀：深圳市潔康清凈電器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇區(qū)華城潤華實驗儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英峪高科儀器。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將收集到新鮮的菠蘿皮渣剔除大顆粒雜質(zhì)，用蒸餾水洗凈后瀝去水分，置于烘箱中55℃干燥36 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，得菠蘿皮渣干粉。取適量菠蘿皮渣干粉，加入適量80%乙醇室溫攪拌浸泡2 h，抽濾，再將菠蘿皮渣置于55℃烘箱中烘干，得去除小分子雜質(zhì)的菠蘿皮渣干粉，儲存于干燥器中備用。

1.2.2 菠蘿皮渣多糖的提取工藝流程

稱取菠蘿皮渣干粉1.0 g→按料液比要求加入適量蒸餾水→復(fù)溶30 min→根據(jù)預(yù)設(shè)定的條件采用超聲波協(xié)同熱水法提取→離心（6 000 r/min，10 min）→取上清液→濃縮→醇沉（乙醇終濃度80%，4℃靜置過夜）→離心（4 000 r/min，10 min）→收集沉淀→用蒸餾水溶解沉淀即得菠蘿皮渣多糖溶液

1.2.3 菠蘿皮渣多糖含量的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考王文平等[16]的方法，并稍作修改。精確吸取質(zhì)量濃度為 100 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于具塞試管中，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL。依次加入1.0 mL新配制得6%苯酚溶液，搖勻后緩慢加入5.0 mL濃硫酸，振蕩均勻后靜置5 min，于沸水浴中加熱15 min，取出后在冷水浴中迅速冷卻至室溫；用2.0 mL蒸餾水按同樣操作作空白，在波長490 nm處測定吸光度。由測得的吸光度和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.011 0x-0.000 2，式中：x為葡萄糖濃度（mg/mL）；y為吸光度，R2=0.999 4，即葡萄糖濃度在0～0.07 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 樣品多糖得率的測定

取稀釋后的樣品溶液1.0 mL于刻度試管中，以蒸餾水為對照，按上述方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量，根據(jù)下式求出各試驗組菠蘿皮渣多糖的得率。

式中：C為樣液中所測葡萄糖的濃度，mg/mL；V為溶液定容體積，mL；N為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；M為菠蘿皮渣干粉質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗

在固定水浴浸提時間1 h、料液比1∶30（g/mL）、超聲水浴溫度50℃、超聲功率160 W、超聲時間20 min的條件下，考察不同水浴浸提溫度（60、70、80、90、100℃）對菠蘿皮渣多糖得率的影響；在固定水浴浸提溫度90℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲水浴溫度50℃、超聲功率160 W、超聲時間20 min的條件下，考察不同水浴浸提時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對菠蘿皮渣多糖得率的影響；在固定水浴浸提溫度90℃、水浴浸提時間2.5 h、超聲水浴溫度50℃、超聲功率160 W、超聲時間20 min的條件下，考察不同料液比[1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]對菠蘿皮渣多糖得率的影響；在固定水浴浸提溫度90℃、水浴浸提時間2.5 h、料液比1∶50（g/mL）、超聲水浴溫度50℃、超聲時間20 min 的條件下，考察不同超聲功率（40、80、120、160、200 W）對菠蘿皮渣多糖得率的影響；在固定水浴浸提溫度90℃、水浴浸提時間2.5 h、料液比1∶50（g/mL）、超聲功率120 W、超聲時間20 min的條件下，考察不同超聲水浴溫度（40、50、60、70、80 ℃）對菠蘿皮渣多糖得率的影響；在固定水浴浸提溫度90℃、水浴浸提時間2.5 h、料液比1∶50（g/mL）、超聲水浴溫度60℃、超聲功率120 W條件下，考察不同超聲時間（20、40、60、80、100 min）對菠蘿皮渣多糖得率的影響。

1.2.5 Plackett-Burman試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計法，對影響菠蘿皮渣多糖得率的6個因素進(jìn)行評價，篩選出主效應(yīng)因子，每個因素設(shè)置低（－1）和高（＋1）兩個水平，共12個試驗組合。另外安排3個空項X3、X6、X9，用于誤差分析。試驗因素及水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Plackett-Burman experimental factor and level

1.2.6 最陡爬坡試驗

響應(yīng)面擬合方程只有在考察結(jié)果的臨近區(qū)域內(nèi)才能充分接近真實結(jié)果，因此要在逼近最佳區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[17]。根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出對菠蘿皮渣多糖得率影響顯著的因素，以及各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)來確定最陡爬坡試驗的變化方向及步長，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

依據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，固定水浴提取時間2.5 h、超聲水浴溫度60℃、超聲功率120 W，選取水浴浸提溫度、料液比和超聲時間3個因素為自變量，以菠蘿皮渣多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計的方法，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，因素及水平編碼見表2。

表2 Box-Benhnken設(shè)計因素及水平編碼Table 2 Factors and levels in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 水浴浸提溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響

水浴浸提溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖1。

圖1 水浴浸提溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of waterbath extraction temperature on the yield of polysaccharide

由圖1可知，在60℃～80℃的水浴中進(jìn)行熱處理，菠蘿皮渣多糖的提取量隨著水浴溫度的升高增大趨勢較緩，當(dāng)水浴溫度達(dá)到80℃后，多糖提取量迅速增大，呈明顯上升趨勢，在溫度為100℃時達(dá)到最大。由此說明水浴溫度的適度提高對植物組織的浸潤具有一定的促進(jìn)作用[18]，有利于多糖的溶出。因此選擇水浴浸提溫度為80℃～100℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2 水浴浸提時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響

水浴浸提時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖2。

圖2 水浴浸提時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of waterbath extraction time on the yield of polysaccharide

由圖2可知，在1.0 h～2.5 h內(nèi)，菠蘿皮渣多糖得率隨著水浴時間的延長顯著增加，當(dāng)水浴時間為2.5 h時，多糖得率達(dá)到最大。2.5 h后，隨著時間的延長，多糖得率略有降低。水浴時間過短，達(dá)不到分離提取效果，進(jìn)而影響多糖得率；水浴時間過長，溶出的多糖長時間暴露在外，導(dǎo)致多糖分解或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[19]，最終影響多糖得率，因此選取水浴浸提時間為2.0 h～3.0 h為宜。

2.1.3 料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響

料液比對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖3。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharide

由圖 3 可知，料液比在 1 ∶20（g/mL）～1∶50（g/mL）范圍內(nèi)，菠蘿皮渣多糖得率隨著溶劑體積的增大而增大，在料液比為1∶50（g/mL）時多糖得率達(dá)到最大，此后繼續(xù)增大料液比，多糖得率增大不顯著。這可能是因為樣品質(zhì)量一定時，料液比過小，物料黏度大，導(dǎo)致多糖溶出受阻；隨著溶劑量的增加多糖浸提越完全，當(dāng)多糖完全溶出時，繼續(xù)增加溶劑量對提取率影響不大。綜合考慮溶劑用量及后續(xù)濃縮能耗等問題，選擇料液比為 1∶40（g/mL）～1∶60（g/mL）為宜。

2.1.4 超聲功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響

超聲功率對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

由圖4可知，菠蘿皮渣多糖得率在40 W～120 W范圍內(nèi)隨著超聲功率的增大而增大，當(dāng)超聲功率為120 W時，多糖得率達(dá)到最大，此后繼續(xù)增加超聲功率，多糖得率逐漸降低。這可能是因為隨著超聲功率的增加，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和振動加強(qiáng)，對細(xì)胞壁的破碎作用不斷增大，有利于多糖的擴(kuò)散溶出。當(dāng)功率達(dá)到一定程度后，溶出的多糖在高功率的超聲波作用下糖苷鍵被打斷，結(jié)構(gòu)遭破壞，進(jìn)而導(dǎo)致多糖得率降低[20]。因此，選擇超聲功率在80W～160 W為宜。

2.1.5 超聲水浴溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響

超聲水浴溫度對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖5。

圖5 超聲水浴溫度對多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic-waterbath temperature on the yield of polysaccharide

由圖5可知，在40℃～60℃范圍內(nèi)，升高溫度能提高菠蘿皮渣多糖的得率，當(dāng)溫度超過60℃時，多糖得率逐漸降低。這可能是因為高溫會引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化[21]，有利于多糖溶出到溶劑中，但過高的溫度又會引起多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[22]，最終影響多糖得率。所以，選取超聲水浴溫度為50℃～70℃為宜。

2.1.6 超聲時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響

超聲時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對菠蘿皮渣多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

由圖6可知，在20 min～40 min范圍內(nèi)，菠蘿皮渣多糖得率隨著超聲時間的延長逐漸增大，當(dāng)超聲40min時，多糖得率達(dá)到最大。40 min后，隨著時間的延長，多糖得率逐漸下降。由Fick擴(kuò)散定律可知得率與提取時間呈正比，在一定的條件下，超聲時間越長多糖得率越高[21]；但時間太長會使擴(kuò)散次數(shù)降低，反而影響多糖得率。故選擇超聲時間為20 min～60 min為宜。

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計對關(guān)鍵影響因素的確定

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。利用Mintab 17軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

表4 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗Table 4 Partial regression coefficients and their significance test

由表4可知，決定系數(shù)R2=0.987 1，校正系數(shù)R2Adj=0.928 8，說明與多糖得率相關(guān)的因素中，由此模型解釋的已經(jīng)超過92%，試驗設(shè)計可靠。其中X1（水浴浸提溫度）、X4（料液比）、X8（超聲時間）是影響菠蘿皮渣多糖得率的主要因素，且對多糖得率的影響在0.05水平上存在顯著差異。所以在下一步的響應(yīng)面分析中，重點考察這3個因素的最優(yōu)水平范圍。對于其余的因素，在后續(xù)試驗中均選擇單因素試驗中的最優(yōu)水平，具體取值為：水浴浸提時間2.5 h、超聲功率120 W、超聲水浴溫度60℃。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗結(jié)果見表5。

由表5可知，隨著水浴浸提溫度和料液比的減小，超聲時間的增加，多糖得率呈先增大后減小趨勢，在水浴浸提溫度為90℃、料液比為1∶50 g/mL、超聲時間為40 min時，多糖得率達(dá)到最大，即把第2組試驗的3個因素的變量值設(shè)為中心點進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Steepest ascent experimental design and results

2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表6。

表6 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Box-Benhnken design and results

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到二次多項回歸方程為：

式中：Y為菠蘿皮渣多糖得率；A為水浴浸提溫度；B為料液比；C為超聲時間。對二元回歸方程的模型進(jìn)行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表7。

由表7可知，回歸模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著（P<0.01），在統(tǒng)計學(xué)上有意義。失擬項的P＞0.05，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。模型的校正決定系數(shù)R2=0.976 7，說明模型擬合程度較好，能夠準(zhǔn)確可靠地預(yù)測和分析多糖得率的大小。方程的一次項 A、B，二次項 A2、B2、C2對多糖得率影響極顯著，一次項C對多糖得率影響顯著，交互項AB、AC、BC對多糖得率均無顯著影響。3個因素對多糖得率的影響主次順序為A＞B＞C，即水浴浸提溫度＞料液比＞超聲時間。

各因素交互作用對菠蘿皮渣多糖得率影響的響應(yīng)面圖見圖7。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis for the established regression model

圖7 各因素交互作用對菠蘿皮渣多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface polts showing the interactive effects of three extraction parameters on the extraction yield of pineapple pomace polysaccharide

由圖7a可知，在料液比一定的條件下，多糖得率隨著水浴浸提溫度的升高而增大，且變化較為明顯。在水浴浸提溫度一定的條件下，多糖得率隨著料液比的增大呈先增大后減小趨勢，其變化不明顯。由等高線圖可知沿水浴浸提溫度方向等高線密集，說明水浴溫度對多糖得率的影響比料液比大，等高線非橢圓形，說明兩個因素的交互作用不顯著。由圖7b可知，當(dāng)超聲時間一定時，多糖得率隨著水浴浸提溫度的升高不斷增大，變化較明顯。而在水浴浸提溫度一定的情況下，多糖得率隨著超聲時間的延長先增大后減小，變化不明顯，說明水浴溫度對多糖得率的影響比超聲時間大。由等高線可知兩個因素的交互作用不顯著。由圖7c可知，在超聲時間一定時，多糖得率隨著料液比的增加先增大后減小，在料液比一定時，多糖得率隨著超聲時間的增加也呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，當(dāng)二者均處于中間水平時多糖得率達(dá)到最大，但兩個因素的交互作用不顯著。

通過Design Expert 8.0.6軟件求解回歸方程得到菠蘿皮渣多糖的最佳提取工藝條件為：水浴浸提溫度98℃，料液比 1∶53（g/mL），超聲時間 42 min，預(yù)測多糖得率為1.67%；但考慮到實際操作的局限性，將菠蘿皮渣多糖的提取工藝參數(shù)修正為：水浴浸提溫度98℃，料液比1∶50（g/mL），超聲時間40 min；為了驗證模型的可靠性，采用上述預(yù)測最佳工藝條件進(jìn)行提取試驗，重復(fù)3次，測得多糖得率為1.62%，與模型預(yù)測值相近，證明模型有效，所得的菠蘿皮渣多糖的提取條件具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

Plackett-Burman試驗設(shè)計可以快速、有效地通過較少的試驗從眾多影響菠蘿皮渣多糖得率的因素中篩選出主要的影響因素，避免了非主要因素可能造成的浪費時間和資源的缺陷。而響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗工具，它能夠找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，克服了傳統(tǒng)正交試驗的缺陷。目前，對菠蘿皮渣多糖的提取工藝報道研究多采用正交設(shè)計法優(yōu)化，這在實際應(yīng)用中受到諸多限制。本試驗通過Plackett-Burman試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗以及在此基礎(chǔ)上的三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，建立了菠蘿皮渣多糖得率與各影響因素間的數(shù)學(xué)模型，并依此模型預(yù)測了菠蘿皮渣多糖的得率，同時結(jié)合實際條件確定出菠蘿皮渣多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：水浴浸提溫度98℃、水浴浸提時間2.5 h、料液比 1∶50（g/mL）、超聲功率 120 W、超聲水浴溫度60℃、超聲時間40 min，在此條件下，菠蘿皮渣多糖理論得率為1.67%，實際得率為1.62%，相差2.99%，說明所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測的菠蘿皮渣多糖得率與實際多糖得率偏差較小，吻合度好，可作為菠蘿皮渣多糖的提取工藝。

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