大蒜素對小鼠酒精性肝纖維化的預防作用研究

李娜，周琪，趙鑫，吳曼曼，李新莉

（大連醫科大學生物技術系，遼寧大連116044）

酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是酒精攝入過量或長期酗酒導致的中毒性肝損傷，初期常誘發脂肪肝，進而發展成酒精性肝炎，損害持續加重可以發展為酒精性肝纖維化（Alcohol liver fibrosi，ALF）甚至酒精性肝硬化，最終導致肝功能衰竭[1]。

大蒜素（Allicin）是從蔥科植物大蒜中提取的具有生物活性的含硫化合物總稱，有特殊氣味，具有較好抗菌、調血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[2]。大蒜素對酒精性肝損傷具有保護作用，其機制研究主要集中于抗肝臟氧化損傷作用[3-4]，而對大蒜素抗肝纖維化的研究罕見報道。ALF是酒精性脂肪肝、肝炎向肝硬化甚至肝癌發展的必經之路，其發生機制是肝內細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的過度沉積與分布異常的結果[5]，肝纖維化可以逆轉[6-7]，因此對其進行有效的治療可以阻斷病情的發展，提高患者的生存率與生命質量。

本課題使用56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立酒精性肝纖維化模型，測定肝功能相關指標，檢測肝組織中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、轉化生長因子-β1（Transforming growth factor beta1，TGF-β1）和飾膠蛋白聚糖（Decorin）蛋白的表達水平，初步探討大蒜素抗肝纖維化的機制，為進一步開發保肝護肝藥物提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市售；護肝片：長春海外制藥集團有限公司，批號：Z22020994，規格：0.35 g；北京 56°紅星二鍋頭：北京紅星股份有限公司；谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、 谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷胱甘肽（Glutathione GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion peroxidase，GSHPX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDLC）測試盒：南京建成生物工程研究所；兔源抗β-actin抗體、兔源抗TNF-α抗體、兔源抗TGF-β1抗體、兔源抗Decorin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗體：武漢三鷹生物技術有限公司；Pierce ECL化學發光試劑盒：Thermo公司；硝酸纖維素膜：大連萬澤貿易有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺：進口試劑，上海雙螺旋生物科技有限公司分裝；RIPA裂解液：北京索萊寶科技有限公司；5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5-disulfide（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、L-半胱氨酸：美國 sigma公司；其他試劑均為市售分析純：中國藥品上?；瘜W試劑公司。

1.2 大蒜素的制備

有機溶劑法[8]提取大蒜素。200 g大蒜去皮搗碎，利用大蒜細胞破碎后產生的蒜氨酸酶40℃下酶解30 min，按料液比 1 ∶4（g/mL）加入 95%乙醇 800 mL，30℃水浴2 h，雙層紗布過濾，濾液用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮得到大蒜素（GA）。DTNB法測定大蒜素含量[9]。取0.5 mL L-半胱氨酸溶液，加1 mL DTNB溶液，用50 mmol/L pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至5.0 mL，26℃保溫15 min，412 nm處測定吸光值A0。取L-半胱氨酸溶液0.5 mL，加0.5 mL 10倍稀釋的大蒜素提取液，26℃保溫15 min加DTNB溶液1 mL，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至5.0 mL，26℃下保溫15 min，412 nm測定吸光值A。大蒜素含量測定方法如下：

式中：ΔA412=A0-A；d為稀釋倍數；14150為 NTB在412 nm，1 cm光徑摩爾消光系數。

1.3 模型建立與分組

SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18 g～22 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2008-0002，本實驗通過大連醫科大學倫理委員會同意。護肝片和大蒜素分別溶于生理鹽水配成護肝片溶液（6 mg/mL）、大蒜素高濃度（200 mg/mL）和低濃度（50mg/mL）溶液。小鼠隨機分為正常對照組（N）、酒精性肝纖維化組（A）、護肝片組（P）、大蒜素高（GA-H）、低濃度組（GA-L），每組8只。除N組和A組，其余各組灌服相應藥物0.2 mL 30 d，末次給藥30 min后，正常對照組灌胃生理鹽水，其余各組灌胃14mL/kg紅星二鍋頭。

1.4 肝功能指標的檢測

小鼠末次給藥禁食12 h，摘眼球取血，室溫靜置1 h，4℃過夜，3 000 r/min 4℃離心10 min，分離血清，備用，按試劑盒方法測定血清ALT和AST水平。處死小鼠，約取肝臟同一位置0.5 g，加入9倍質量的冷生理鹽水，制成10%的肝組織勻漿，8 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液，按試劑盒方法測定肝臟中TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C 和 LDL-C 等肝功能指標。

1.5 小鼠肝臟病理組織學觀察

取小鼠左葉肝臟，用10%冷甲醛固定，制作石蠟切片，H&E染色，高倍顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學變化。

1.6 Western-blot檢測 TNF-α、TGF-β1和 Decorin的表達水平

各組取50 mg～100 mg肝組織在冰浴上剪成碎片，用預冷的生理鹽水洗滌2次。加入0.5 mL預冷的蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿 20次～40次，直到95%的細胞破碎，在冰浴中放置30 min。12 000 r/min 4℃離心15 min，將上清液轉移到新的離心管，分裝，-80℃保存備用。常規SDS-PAGE電泳，每組肝組織蛋白上樣量為100μg，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，待預染Marker充分被分開，停止電泳。用半干式電轉儀進行轉膜。脫脂奶粉封閉NC膜1 h。分別與一抗βactin（1 ∶500 稀釋）、TNF-α（1 ∶500 稀釋）、TGF-β1（1 ∶500稀釋）、Decorin（1∶500稀釋）結合，4℃過夜，TBST洗膜，于二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗體（1∶5000稀釋）孵育2 h，ECL發光，凝膠成像。以β-actin為內參，采用Quantity One 4.6.2軟件進行蛋白灰度值分析，各蛋白表達量是與內參的比值。

1.7 數據分析

數據分析在SPSS 10.0軟件包中處理，正態計量指標采用均數±標準差（±SD）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P值＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大蒜素的制備

采用有機溶劑法，得到大蒜素GA 14.54 g，產率為7.27%。采用DTNB法測定大蒜素含量為0.978%。

2.2 肝功能指標的檢測

大蒜素對小鼠血清ALT和AST的影響見表1。

表1 大蒜素對小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of allicin on serum activity of ALT and AST（±s，n=8）

表1 大蒜素對小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of allicin on serum activity of ALT and AST（±s，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別A L T/（U/L）A S T/（U/L）正常對照組（N） 5.6 5±0.8 6 2 3.2 2±4.0 9酒精性肝纖維化組（A） 2 0 2.9 6±1 0.8 0## 4 9.1 3±1 0.8 3##護肝片組（P） 5 6.6 9±2 5.4 0** 3 2.7 1±1.8 2**大蒜素高濃度組（G A-H） 1 2.6 7±3.0 6** 2 3.1 3±1.6 7**大蒜素低濃度組（G A-L） 1 4.5 4±5.3 5** 2 9.5 3±0.4 4**

與正常對照組相比，酒精性肝纖維化組ALT和AST活性顯著增強（P＜0.01），表明小鼠肝臟受到嚴重損傷。與肝纖維化模型組相比，護肝片、大蒜素高（200 mg/mL）和低（50 mg/mL）濃度組小鼠血清ALT和AST肝功能酶活性顯著降低（P＜0.01），且大蒜素的效果要優于護肝片，以上結果表明，大蒜素可降低血清中ALT和AST的活性，對小鼠肝臟具有保護作用。

大蒜素對小鼠肝均漿液中 TC、TG、GSH、GSHPX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響見表 2。

表2 大蒜素對小鼠肝勻漿液中 TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of allicin on TC，TG，GSH，GSH-PX，SOD，MDA，HDL-C and LDL-C in liver（±s，n=8）

表2 大蒜素對小鼠肝勻漿液中 TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of allicin on TC，TG，GSH，GSH-PX，SOD，MDA，HDL-C and LDL-C in liver（±s，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

L D L-C/（m m o l/L）正常對照組（N） 1 2 0.6 9±2 8.9 6 1.9 8±0.2 1 7 6.4 5±1 7.2 1 4 8 9.7 4±6 1.9 9 4.2 8±0.3 9 2.9 8±1.3 6 6.2 1±1.3 3 0.0 9 9±0.0 4 5酒精性肝纖維化組（A） 9 0.1 2±1 5.5 0## 4.1 2±1.5 3## 5 0.1 2±1 1.3 2## 2 6 6.1 7±7 3.5 1##5.3 0±1.2 2 3.2 4±0.9 8 5.9 8±1.4 6 0.4 4±0.1 2##護肝片組（P） 1 1 2.2 3±2 2.2 1** 2.8 5±0.5 3** 8 0.3 2±1 9.1 3** 5 2 3.7 2±7 6.1 1**4.9 6±1.5 4 3.0 5±1.2 0**6.0 7±2.0 2 0.1 6±0.0 5**大蒜素高濃度組（G A-H） 1 1 7.3 5±1 7.3 4** 3.5 8±1.9 7* 7 1.2 1±1 7.5 6** 4 5 0.4 9±5 1.9 8**4.8 9±1.5 4 3.3 3±1.9 7**6.1 4±2.3 1 0.1 3±0.0 2 1**大蒜素低濃度組（G A-L） 9 8.8 9±2 0.4 3 4.0 1±0.6 3 6 5.2 1±2 9.2 1* 2 5 7.8 4±6 3.1 3 5.0 7±0.3 2 3.6 9±1.3 6**5.9 2±2.1 7 0.3 4±0.0 5組別S O D/（U/m g）M D A/（n m o l/m g）G S H/（μ m o l/g）G S H-P x/（U/m g）T C/（m m o l/L）T G/（m m o l/L）H D L-C/（m m o l/L）

與正常對照組相比，酒精性肝纖維化組小鼠肝均漿液中SOD、GSH-PX活性和GSH含量均顯著減少（P<0.01），而MDA 和 LDL-C含量顯著增加（P<0.01），這表明酒精性肝纖維化組小鼠肝臟受損嚴重。與酒精性肝纖維化組相比，護肝片組和大蒜素高濃度（200 mg/mL）組SOD、GSH-PX活性和GSH含量顯著增加（P<0.01），而MDA和LDL-C的含量降低，這表明大蒜素不僅能夠增強肝纖維化組小鼠肝臟抗氧化酶活力，還可顯著降低其肝臟的脂質過氧化水平。

2.3 小鼠肝臟病理組織學觀察結果

小鼠肝臟切片后，采用H&E染色，在200倍顯微鏡下觀察不同處理組小鼠肝組織損傷情況如圖1所示。

圖1 各組小鼠肝組織切片蘇木伊紅染色結果（×200）Fig.1 Hematoxylon and eosin（H&E）staining of mice liver tissues lices（Mag.200×）

正常對照組小鼠肝細胞結構完整、大小相近，以小葉中央靜脈為中心，胞核大而呈圓形或橢圓形，胞漿染色均勻，未見肝臟病變。模型組小鼠肝小葉界限不清，肝細胞索紊亂，肝竇變窄，肝細胞明顯腫脹，部分區域出現氣球樣變和炎細胞浸潤，由此可見酒精對肝臟有明顯的損傷。護肝片組和大蒜素高濃度組（200 mg/mL）均呈現與酒精性肝纖維化組相似的肝臟病變，但與酒精性肝纖維化組相比，肝細胞腫脹減輕，細胞核進一步正常化，小鼠肝組織得到了一定的修復。

2.4 Western-blotting檢測 TNF-α、TGF-β1和 Decorin的表達水平

Western-blot檢測肝組織中 TNF-α、TGF-β1 和Decorin的表達水平。分析各蛋白條帶灰度，進行半定量比較，以目的基因的條帶灰度與管家基因β-actin的灰度比值表示蛋白的表達水平，結果如圖2所示。

圖2 Western-blot法檢測TNF-α、TGF-β1和Decorin表達水平及各蛋白與β-actin灰度值比值Fig.2 The expression and gray scale value ratio of TNF-α，TGF-β1 and Decorin

上述結果顯示，與正常對照組（N）比較，酒精性肝纖維化組（A）小鼠肝組織TNF-α和TGF-β1的表達水平顯著升高（P<0.01），而Decorin的表達水平顯著降低（P<0.01）；與酒精性肝纖維化組相比，護肝片組、大蒜素高和低濃度組小鼠肝組織中TNF-α的表達水平降低，大蒜素高和低濃度組TGF-β1的表達水平顯著降低（P<0.01），且大蒜素高濃度組中Decorin表達水平升高，具有顯著性的差異。

3 結論與討論

在已探明的酒精性肝病的損傷機制中，氧化應激是最為關鍵的影響因素[10]。酒精通過增加活性氧和消耗抗氧化劑而加重氧化應激。長期大量酒精的攝入使肝細胞線粒體內GSH含量明顯下降，從而加劇對線粒體結構和功能的損害，飲酒造成營養吸收不良也使食物中的抗氧化劑吸收減少。同時，酒精在經微粒體氧化酶代謝后可生成大量活性氧自由基，引發脂質過氧化。氧負離子和活性氧自由基可直接氧化生物膜、蛋白質、核酸等大分子物質，破壞其功能和完整性。脂質過氧化可誘導炎細胞浸潤，產生大量炎癥介質并激活TNF-α和TGF-β1，激活Kupffer細胞和肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC），促進 HSC 分泌眾多細胞外基質（Extracellular matrix，ECM），導致了肝纖維化的發生和發展。Decorin作為ECM的一個主要組分，在正常肝臟中是微量的，隨纖維化進展其含量穩定增加，具有突出的抑制膠原纖維合成以及負反饋調控TGF-β1活性的功能，在TGF-β1功能調節中起重要作用[11]。

大蒜素具有多種生物學功能，對酒精性肝損傷具有保護作用，目前其機制研究主要集中于清除自由基，抑制肝臟過氧化等。針對酒精性肝損傷會發展成肝纖維化和肝硬化這一嚴重問題，本研究建立小鼠酒精性肝纖維化模型，測定血清ALT和AST等肝功能酶活性，發現酒精性肝纖維化組小鼠ALT和AST活性顯著增強，護肝片和大蒜素灌胃后ALT和AST降低。據報道，ALT和AST主要存在于細胞核和線粒體內，當肝細胞明顯損害時釋放入血，ALT和AST的升高均為反映肝功能受損的特異性指標，因此，大蒜素可降低血清中ALT和AST的活性，對小鼠肝臟具有保護作用。肝臟中SOD與GSH是機體中抗氧化系統的重要組成部分，能清除體內自由基，從而防止自由基對機體的損傷。酒精的代謝產物乙醛與GSH的巰基結合，使GSH水平進一步下降，從而減弱機體的內源性抗氧化能力。MDA為脂質過氧化反應的終產物，當肝臟所受的損傷越嚴重時，肝臟內的MDA含量越高，故可通過測定肝組織勻漿中的SOD、GSH和MAD的變化，以評價大蒜素的護肝作用。本試驗中護肝片組和大蒜素高濃度（200 mg/mL）組SOD、GSH-PX活性和GSH含量顯著增加，而MDA和LDL-C的含量降低，這表明大蒜素不僅能夠增強酒精性肝纖維化小鼠肝臟抗氧化酶活力，還可顯著降低其肝臟的脂質過氧化水平。小鼠肝組織病理切片也顯示酒精對肝臟有明顯的損傷，大蒜素使肝細胞腫脹減輕，細胞核正?；∈蟾谓M織得到了一定的修復。本試驗繼續對大蒜素抗肝纖維化作用展開研究，采用Western blotting方法對肝臟纖維化的相關蛋白進行分析，結果顯示大蒜素灌胃后小鼠肝組織中TNF-α和TGF-β1的表達水平顯著降低，而Decorin表達水平升高。

綜上，推測大蒜素對酒精性肝纖維化的預防作用機制不僅與增強機體抗氧化能力有關，還與干預TNF-α、TGF-β1和Decorin等纖維化相關蛋白的表達有關。大蒜素能夠促使肝細胞的抗氧化能力增強，抵御脂質過氧化，降低肝細胞受損程度。TNF-α、TGF-β1和Decorin的表達是組織ECM異常增多的重要因素，它們在肝損傷的發生發展中起著重要作用，這也為我們進一步研究預防酒精性肝損傷的相關機制和有效藥物提供新的思路與途徑。

[1]Domitrovi R.The molecular basis for the pharmacological activity of anthocyans[J].Curr Med Chem,2011,18(29):4454-4469

[2]于洋,徐冶,劉師兵,等.大蒜素對D-半乳糖致衰老模型大鼠學習記憶能力及腦組織氧化應激相關蛋白的影響[J].解放軍醫學雜志,2015,40(11):880-884

[3]黃杰安,丁虹.大蒜素對乙醇性肝損仿的保護作用[J].世界華人消化雜志,1999,7(5):427-428

[4]楊融輝,吳晗,張寧.大蒜素抗氧化活性及其生物效應的研究進展[J].東南大學學報,2015,34(6):1037-1040

[5]王玨云,趙公澤,白鑫潔,等.柴胡解毒湯對實驗性酒精性肝纖維化復合模型大鼠Col-IV,HA的影響[J].現代生物醫學進展,2017,17(11):2016-2019

[6]潘婷,張金娟,熊英,等.舒肝寧注射液對大鼠酒精性肝纖維化的防治作用研究[J].中國藥房,2017,28(19):2624-2627

[7]Lee Y,Friedman SL.Fibrosis in the liver acute protection and chronic disease[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2010,97:151-200

[8]林真亭.大蒜素的提取及體外抗菌活性觀察[J].海峽藥學,2014,26(4):64-66

[9]朱薿,應惠芳.大蒜中大蒜素含量簡便測定法[J].食品科技,2008,33(8):202-204

[10]劉歡,陳英利,張冰,等.酒精性肝損傷的氧化應激和同型半胱氨酸促進肝細胞凋亡及其機制[J].哈爾濱醫科大學學報,2015,49(3):219-224

[11]Goetsch KP,Niesler CU.The extracellular matrix regulates the effect of decorin and transforming growth factor beta-2(TGF-β2)on myoblast migration[J].Biochem Bioph Res Co,2016,479(2):351-357