食品中N-亞硝胺類化合物檢測方法研究進展

（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461）

亞硝酸鹽廣泛存在于食品之中，很容易與胺化合，生成亞硝胺。亞硝胺與苯并芘、黃曲霉素是世界公認的三大強致癌物質(zhì)[1]。長期小劑量食用含亞硝胺的食品就可以使人致癌[2]。隨著人們健康意識的逐步提高，對食品品質(zhì)要求越來越高，對于食品中的N-亞硝胺類化合物污染問題也越來越受到關(guān)注[3]。清華大學(xué)陳超副研究員課題組調(diào)查全國飲用水供水系統(tǒng)，在水中檢查發(fā)現(xiàn)了9種亞硝胺類有毒物質(zhì)，該事件引起了全國范圍對亞硝胺的關(guān)注[4]。近年來，對N-亞硝胺類化合物分析方法的改進和以快速、準確、環(huán)保為目的分析方法的建立與發(fā)展，已經(jīng)成為了食品安全領(lǐng)域的一個研究熱點。本文對近幾年食品中的N-亞硝胺類化合物分析研究檢測方法進行了簡要綜述。

1 N-亞硝胺類化合物的種類

N-亞硝胺類化合物簡稱為亞硝胺[5]，通式見圖1。當R1和R2相同時，稱為對稱性亞硝胺，當R1和R2不同時，稱為非對稱性亞硝胺[6-7]。常見的N-亞硝胺類化合物見表1。

圖1 N-亞硝胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式Fig.1 Structure of N-nitrosamines

表1 常見的N-亞硝胺類化合物的中文名稱、英文名稱、CAS編號、分子式、結(jié)構(gòu)式Table 1 The Chinese name，English name，CAS number，molecular formula and structural formula of the common N-nitrosamines compounds

2 N-亞硝胺類化合物的危害

亞硝胺化合物種類繁多，亞硝胺的毒性隨著其烴鏈的延長而逐漸降低。食品中毒性最大的就是NDMA，其主要是造成肝臟損傷和血小板破壞[8]。N-亞硝胺類化合物很少存在于自然界，但亞硝酸鹽和胺類卻廣泛存在[9]。人們通過攝入含有亞硝酸鹽和胺類的食物，在胃部一定條件下形成N-亞硝胺類化合物[10-12]，反應(yīng)方程式見圖2。

圖2 胺類物質(zhì)與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺Fig.2 Amines react with nitrites to form nitrosamines

雖然亞硝胺屬于高致癌物[13-14]，但是也沒必要過分擔心。中國畜產(chǎn)品加工研究會、中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院等有關(guān)專家表示，離開攝入量談食品的致癌風險是沒有意義的，致癌物只是有致癌的潛在風險[15]。比如肉制品加工中會添加亞硝酸鹽，加工后會形成亞硝酸胺，如果按照國家標準添加，食用對人體無害。

3 N-亞硝胺類化合物國家限量要求

早在1988年國家衛(wèi)生部就制定了肉制品中NDMA的限量要求。1999年和2005年國家衛(wèi)生部及標準化管理委員會重新制定N-亞硝胺類化合物限量標準。標準中檢測食品類別增加了海產(chǎn)品，檢測項目也增加了NDEA。2012年國家衛(wèi)生部通過對我國居民近年膳食污染物的暴露量評估分析，又參照國際食品法典委員會（CAC）制定的《食品和飼料中污染物和毒素通用準則》、歐盟委員會No 1881/2006指令、澳新食品標準局制定的《食品法典標準》，頒布了最新的N-亞硝胺類化合物限量標準。N-亞硝胺類化合物檢測標準名稱和限量要求見表2。

表2 N-亞硝胺類化合物檢測標準和限量要求Table 2 N-nitrosamine compounds detection limit requirements and standards

4 常用的N-亞硝胺類化合物的檢測方法

4.1 氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）

GC是檢測N-亞硝胺類化合物比較傳統(tǒng)的方法，其檢測器一般采用火焰電離檢測器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）。彭俏容[20]在測定啤酒中的NDMA中就用到帶火焰電離檢測器的氣相色譜（GC-FID）的檢測方法。啤酒樣品先進行冷凍熔煉前處理，再上機分析，分析得出NDMA在5 mg/L～200 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r2=0.999 6），儀器的檢出限（Limit of De tection，LOD）為0.51 mg/L，方法的定量限（Limit of Quantitation，LOQ）為 1.26mg/L，在5、10、20mg/L3個加標水平下的回收率分別為84.94%、83.24%、85.14%，平行7次測定的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為3.06%、3.19%、2.63%。熊鳳嬌[21]在分析魚糜制品中揮發(fā)性N-亞硝胺含量時，用安捷倫7890A氣相色譜儀測定。得到10種魚糜制品中普遍存在8種揮發(fā)性N-亞硝胺：NDMA（0.2μg/kg～18.2μg/kg）、NMEA（0μg/kg～12.8μg/kg）、NDEA（0.6μg/kg～23.6μg/kg）、NDPA（0.2 μg/kg～5.9 μg/kg）、NDBA（0 μg/kg～14.8 μg/kg）、NPIP（0 μg/kg～1.7 μg/kg）、NPYR（0 μg/kg～8.7 μg/kg）及 NMorPh（0.5 μg/kg～5.0 μg/kg）。NDPhA 僅在蝦丸中檢出，含量為（6.0±1.7）μg/kg。GC雖然分析簡便快捷，但由于其必須用已知物與相應(yīng)的色譜峰進行對比，依靠保留時間定性，缺乏特異性。在樣品基質(zhì)比較復(fù)雜的情況下亞硝胺的分析效果不理想。

4.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry ，GC-MS）

GC-MS不僅利用了色譜高效的分離能力，而且還發(fā)揮了質(zhì)譜好定性的特點，大大提高了定性的準確性，靈敏度比GC-FID大大提高了。GC-MS檢測亞硝胺實驗條件及檢測情況見表3。

4.3 氣相色譜—熱能分析儀法（Gas Chromatography-Thermal Energy Analyzer，GC-TEA）

熱能分析儀是一種氮專屬檢測器，對氮具有等摩爾響應(yīng)，靈敏度高、特異性好、線性范圍寬等特點。張紅[26]等在測定水產(chǎn)品中亞硝胺時使用GC-TEA，樣品經(jīng)蒸餾、萃取、濃縮后上機分析得到四種揮發(fā)性N-亞硝胺線性范圍是 0.2 μg/mL～4.0 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2最高的是NDMA，R2為0.999 4，方法檢出限為0.001 mg/kg。馮新昌[27]使用GC-TEA測定食品中的揮發(fā)性亞硝胺，其中108份樣品檢出亞硝胺，主要為NDMA，平均含量為0.83 μg/kg，在抽檢的52份肉制品當中，香腸的亞硝胺平均含量最高，NDMA平均含量為1.10 μg/kg，NDEA 平均含量為 0.005 μg/kg，NPYP 平均含量為0.44 μg/kg。GC-TEA作為現(xiàn)行國標亞硝胺檢測的第一法，相比其它檢測方法有很大優(yōu)勢。GC使用FID檢測器檢出限只能達到mg/kg級別，當GC-MS連用后其檢出限才能達到ppb級別。由于FID檢測器缺乏特異性及靈敏度，在定性和定量亞硝胺時存在著不小的難度，其方法已經(jīng)被GC-MS取代。GC-MS與GCTEA相比，兩個實驗方法的靈敏度相同，但在處理基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時候，尤其存在相似性質(zhì)物質(zhì)干擾時，GC-MS結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性就比不上GCTEA，因此在處理基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時，GC-MS比GC-TEA要對樣品多進行一步凈化前處理，實驗步驟比GC-TEA麻煩，實驗成本也較高。

表3GC-MS檢測亞硝胺實驗條件及檢測情況Table 3 Experimental conditions and detection of nitrosamine by GC-MS

4.4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）

復(fù)雜基質(zhì)樣品進行多種亞硝胺成分檢測時，使用GC-MS方法很難得到滿意結(jié)果。有些亞硝胺不易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性差，GC-MS對于這類亞硝胺無法檢測，其次對于含多種亞硝胺、物質(zhì)成分較為復(fù)雜的樣品GCMS的分離效果不盡如人意。對于GC-MS這些局限性，HPLC可以更好的分離，尤其是熱穩(wěn)定性差的亞硝胺，而HPLC-MS的聯(lián)用可以在分離的基礎(chǔ)上進行定量分析。用HPLC分析肉制品中亞硝胺類化合物時，洪凰[28]將樣品與氯化鈉水溶液混合進行蒸餾，餾出液過Ambersorb 572 SPE柱。然后洗脫，氮吹濃縮。濃縮液再進行脫亞硝基化反應(yīng)后，乙腈定容，過有機濾膜待測。色譜柱選用ODS-2 Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 30 ℃，進樣體積 50μL，流速 1.0 mL/min，流動相為乙腈-水（體積比55∶45），激發(fā)波長350 nm，發(fā)生波長530 nm。NDMA檢出限為0.5 μg/kg、NDEA和NPIP檢出限均為2.0 μg/kg。相比于食品，水中亞硝胺的檢測前處理較簡單，錢靜汝[29]把水樣過濾后經(jīng)固相萃取，濃縮和富集后上液質(zhì)，得到NDMA在1 μg/L～50 μg/L線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.998。同樣朱翔[30]用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測水中9種亞硝胺，也得到良好的檢測結(jié)果，9種亞硝胺檢出限范圍是1.3 ng/L～2.8 ng/L，定量限范圍是4.0 ng/L。

4.5 二次展開光解薄層層析法

亞硝胺對光敏感，在光照條件下就可以發(fā)生催化降解。Preussmann等率先使用薄層層析法檢測亞硝胺。魏天俊等[31]在此基礎(chǔ)上提出二次展開光解薄層層析法，其先用無氧乙醚萃取亞硝胺，再將萃取濃縮液滴至活化后的硅膠板上，待溶劑上升到距離原點3 cm～4 cm時，使用無濾光片的紫外分析燈照射10分鐘后，再等溶劑上升到距原點10 cm處，噴Griess試劑進行顯色。如果樣品中含有亞硝胺，則在距原點不足3cm處就有玫瑰紅色斑點出現(xiàn)。

5 展望

食品中可能存在的N-亞硝胺類化合物種類很多，使用 GC-MS、GC-TEA、HPLC-MS、UPLC-MS/MS 都可以較靈敏的檢測多種N-亞硝胺類化合物。因為HPLC-MS、UPLC-MS/MS檢測亞硝胺保留時間過長，在大批量檢測樣品時費時費力，而GC-TEA儀器價格昂貴，所以GC-MS應(yīng)該是檢測N-亞硝胺類化合物儀器首選。不過由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，亞硝胺含量較低，前處理過程中萃取、凈化提取亞硝胺比較困難，因此目前亞硝胺的檢測分析方法除了要向操作簡單、快速、靈敏的方向發(fā)展外，還應(yīng)該大力發(fā)展樣品在線萃取凈化等新技術(shù)。

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