不同種類腐乳游離脂肪酸組成分析及營養評價

解春芝，曾海英，宋 杰，秦禮康*

（1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 明德學院，貴州 貴陽 550025）

腐乳源于中國，至今已有一千多年的生產歷史，與豆豉、醬油、豆醬并稱為我國四大傳統發酵調味品[1]，因其質構與奶酪相似，故又被歐美譽為“中國干酪”[2]。腐乳營養豐富、味道鮮美、風味獨特、品種多樣，倍受消費者青睞，年產量逾300 000 t[3]。根據前酵菌種類型可分為毛霉型腐乳、細菌型腐乳、自然發酵型腐乳以及酶促型腐乳；根據色澤風味分類，可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳、醬腐乳和各種花色腐乳；根據規格形狀又可分為太方腐乳、行方腐乳、醉方腐乳、中方腐乳、棋方腐乳[2，4]。

脂肪作為腐乳中重要組成部分，約占腐乳干質量的20%～30%[5]。在發酵過程中，大量微生物分泌的酶系將脂肪分解成脂肪酸和甘油，是腐乳獨特風味和細膩滑嫩質構形成物質之一。作為腐乳風味形成的重要前體物質，脂肪酸氧化產生的風味物質主要是醛類、酮類、醇類、羧酸類、呋喃類等[6]。此外，大量研究表明，攝入適當比例的飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸，可預防心腦血管疾病、癌癥、關節炎，降低炎癥和結腸炎的發病率[7-8]。

目前，針對腐乳脂肪酸的報道較少，僅局限于1～3種市售腐乳或自制腐乳[9-10]，限制了人們對不同腐乳脂肪酸營養價值的整體認知。本課題根據前酵菌的不同，采集了不同類型的8種腐乳，通過氣-質聯用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）測定腐乳游離脂肪酸的種類和含量，采用主成分分析法（principalcomponentanalysis，PCA）分析其脂肪酸組成差異，綜合評價其營養價值，以期為腐乳生產工藝改善及消費者選購提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集的8種腐乳樣品，分屬于細菌型、毛霉型以及自然發酵型腐乳三大類型，源于全國各地，樣品信息見表1。其中，作為中國腐乳主要類型的毛霉型腐乳樣品包括了紅方（RS）、白方（WS）、青方（GS）、醬方（JS）和花色腐乳（糟方腐乳，ZS；白菜腐乳，CS）。細菌型腐乳和自然發酵型腐乳分別以克東腐乳（KS）和貴州土腐乳（SS）為代表。

硫酸、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、酚酞、石油醚（均為分析純）：北京北化精細化學品有限責任公司。

表1 不同腐乳樣品信息Table 1 Details of different sufu varieties

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C GC-MS聯用儀：美國安捷倫科技公司；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；SER148全自動脂肪提取儀：意大利威爾普公司；GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

同種腐乳5瓶樣品中各取出100 g腐乳塊（共500 g），于蒸餾水中5 min洗去表層輔料，放漏斗上瀝干水分，去除表皮（0.5 cm）后混料進行冷凍干燥，再研磨過60目篩，稱取適量冷凍干燥過的腐乳樣品，采用全自動索氏抽提儀提取脂肪，并于紅外烘箱干燥至質量恒定，-20℃儲存備用。

1.3.2 總游離脂肪酸測定

總游離脂肪酸測定參考標準NY/T 1797—2009《油菜籽中游離脂肪酸的測定》，樣品預處理略有改動，見1.3.1。

1.3.3 游離脂肪酸測定[11]

樣品的甲酯化：稱取腐乳抽提的油脂樣品約30 mg，放入密封瓶中，加1%硫酸甲醇溶液2 mL，在70℃恒溫箱中加熱1 h甲酯化后，加入2 mL正己烷萃取，超聲振蕩，靜置，取上清液，用純水洗滌至中性，加入無水硫酸鈉1 g（吸水），濃縮至1 mL備用。

色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫60℃，保持2 min，以10℃/min升溫至160℃，再以5℃/min升溫至300℃，運行40 min；汽化室溫度為250℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；柱前壓7.62 psi；載氣流速1.0 mL/min；分流比20∶1，溶劑延遲時間為5.0 min，進樣量1 μL。

離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 718 V；接口溫度280℃；質量掃描范圍29～500 amu。

將總離子流圖中的各峰進行質譜計算機數據系統檢索，并核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，確定脂肪酸，用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對質量分數。并計算出不同腐乳中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA），單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA），多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），不飽和指數（unsaturation index，UI），動脈粥樣硬化指數（atherogenic index，AI）以及血栓指數（thrombogenic index，TI）。各指標的計算公式如下：

SFA=C14:0+C15:0+C16:0+C17:0+…+C25:0；

MUFA=C16:1 n-7+C18:1 n-9+C20:1 n-9；

PUFA=C18:2 n-6；

UI=1×單烯酸含量（%）+2×二烯酸含量（%）+3×三烯酸含量（%）+…n×n烯酸含量（%）；

AI=[C12:0+（4×C14:0）+C16:0]/（MUFAs+n-3 PUFAs+n-6 PUFAs）；

TI=（C14:0+C16:0+C18:0）/[（0.5×MUFAs）+（0.5×n-6 PUFAs）+（3 × n-3 PUFAs）+（n-3 PUFAs/n-6 PUFAs）]。

1.3.4 數據分析

數據采用SPSS20.0軟件進行數據處理和主成分分析。在方差分析結果顯著時，采用Duncan法進行多重比較。經PCA提取出主成分后，計算主成分特征值和累積貢獻率，并以每個主成分所對應的特征值的方差貢獻率作為權數，構建綜合評價模型。

2 結果與分析

2.1 不同腐乳中總游離脂肪酸含量

不同腐乳樣品中總游離脂肪酸的含量見圖1。

圖1 不同腐乳中總游離脂肪酸的含量Fig.1 Total free fatty acid contents of different sufu varieties

由圖1可知，白菜腐乳CS總游離脂肪酸含量最高，達18.85 g/100 g，其次為紅腐乳RS（16.82 g/100 g）和青腐乳GS（15.68g/100g）。細菌型KS（8.09 g/100 g）總游離脂肪酸含量最低，僅為CS的43%。由此可知，不同種類腐乳游離脂肪酸的含量差異顯著，即使同種腐乳，發酵時間不同，脂肪酸含量也存在差別。究其原因，一方面，制作腐乳的原料大豆和輔料中脂肪及游離脂肪酸含量原本存在差異[12]，如細菌型腐乳KS主要以東北春大豆為原料，自然發酵型腐乳SS主要以云貴高原夏大豆為原料，而毛霉型腐乳由于分布廣泛，其原料都來源也較為多樣，包括黃淮海平原和長江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳微生物區系不同，脂肪酶活力具有差異，進而導致脂肪的降解程度也不盡相同。有報道表明，在前酵培菌階段，細菌型腐乳以藤黃微球菌（Micrococcus luteus）為主，蛋白酶活力較高[13]，而毛霉型腐乳以五通橋毛霉、雅致放射狀毛霉、腐乳毛霉、總狀毛霉為主，總狀毛霉分泌脂肪酶活力最強，可達到119.2U/g，且酶活力大小依次為總狀毛霉＞雅致放射狀毛霉＞五通橋毛霉＞腐乳毛霉[14]。此外，14碳以上的高級飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在常溫下狀態不同，其含量的高低和種類的多少密切影響著脂肪的結構，性質及脂肪晶形等，進而影響腐乳的微觀結構[15]。因此，發酵過程中游離脂肪酸的釋放，有益于腐乳細膩質構的形成。

2.2 不同腐乳游離脂肪酸含量

表2 不同腐乳游離脂肪酸含量和營養評價指標Table 2 Free fatty acid profiles and nutrition evaluation indexes of different sufu varieties

不同腐乳游離脂肪酸含量見表2，共檢測出15種游離脂肪酸，其種類相似而含量差異顯著（P＜0.05）。根據飽和度分類，所測游離脂肪酸可分為飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）。其中SFA包括：肉豆蔻酸（C14:0）、十五烷酸（C15:0）、棕櫚酸（C16:0）、十七烷酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、二十烷酸（C20:0）、二十一烷酸（C21:0）、山崳酸（C22:0）、二十三烷酸（C23:0）、木蠟酸（C24:0）和二十五烷酸（C25:0）。肉豆蔻酸是人體內主要的SFA，與血清中膽固醇含量呈正相關，可能是導致膽固醇升高的最主要因子[16]，但也可減少前列腺增生發生幾率[17]。而棕櫚酸作為腐乳最主要的SFA，其比重為10.99%～13.72%。但飲食中過多的攝入棕櫚酸，可抑制脂肪氧化和能量消耗，進而可能增大肥胖和胰島素抵抗風險[18]。MUFA包括棕櫚油酸（C16:1n-7）、油酸（C18:1n-9）和11-二十碳烯酸（C20:1n-9），其中含量最豐富的為油酸（22.29%～28.16%）。研究表明，油酸不僅可軟化血管，在人和動物的新陳代謝過程中起著重要作用，還可減緩食品中油脂結晶化[19]。亞油酸（C18:2）是腐乳中唯一的PUFA，同時也是腐乳中最為豐富的脂肪酸，百分含量高達43.36%～50.74%。研究發現，亞油酸可降低氧化損傷，通過與膽固醇結合，還可維持血液膽固醇正常的運轉和代謝。膳食中亞油酸的缺乏，可增大飽和脂肪酸與膽固醇結合的幾率，促進動脈粥樣硬化，進而引發心腦血管相關疾病[20]。KIM J S等[11]對中國不同腐乳進行研究，同樣發現亞油酸（830 mg/100 g鮮樣）含量最為豐富，油酸和棕櫚酸次之。此外，油酸和亞油酸不僅是必需要脂肪酸，也可與醇類物質發生酯化反應生成酯類物質，對腐乳中酸味、果香等獨特風味物質生成具有重要貢獻[21-22]。

由表2可知，在8種腐乳中，SFA含量均較低，占比分布在16.84%～19.39%，含量最高的為SS，含量最低的為ZS。不飽和脂肪酸作為主要脂肪酸，其中MUFA百分含量為22.67%～28.34%，PUFA為43.36%～50.74%。不同腐乳PUFA/SFA比值差異不顯著（P＞0.05），最大的為KS（2.83）。而PUFA/MUFA比值分布在1.53～2.11之間，最大的為KS，最小的為ZS。脂肪酸比值對人體健康具有重要意義，高PUFAs/SFAs值有利于血清膽固醇和動脈粥樣硬化的減少，并可預防心臟疾病[23]。PUFA/SFA比值作為評價油脂質量的重要指標，推薦最低值為0.45[24]。所有腐乳的PUFA/SFA比值遠遠高于0.45，說明腐乳的各脂肪酸比例合理。

脂肪酸和人體健康密切相關，不飽和指數（UI）作為評價脂肪酸飽和程度的一個重要指標，與Ⅱ-型糖尿病具有一定的關聯度。而動脈粥樣硬化指數（AI）和血栓指數（TI）越高，越易于患相關的疾病，對人體的潛在危害越大[24]。腐乳UI指數為112.17～127.05，AI（0.16～0.19）和TI（0.42～0.50）指數均低于0.5，遠遠低于藥用海藻相關指數（AI：0.94～1.99；TI：0.46～1.60）[24]。腐乳中UI、AI和TI指數相對合理，可能源于亞油酸含量較高，對預防Ⅱ-型糖尿病和心腦血管疾病具有潛在意義。

2.3 腐乳游離脂肪酸主成分分析

主成分分析法是多元統計中的一種數據挖掘技術，利用降維的原理，在保留主要變量信息的前提下，可把多個指標轉化為幾個不相關的綜合變量[25]。主成分分析在滿足數據降維的同時，能夠客觀地確定各個指標的權重，避免了主觀隨意性，具有一定的優越性[26]。因此，已被廣泛應用于食品品質分析中[27-28]，主成分的特征值和貢獻率見表3。由表3可知，前3個主成分的貢獻率分別為68.626%、26.251%、3.834%，累計貢獻率為98.711%，確定提取3個主成分最合適，可較好反映所有游離脂肪酸組成的基本信息。

表3 主成分的特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rate and of the principal components

表4 主成分的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

主成分的載荷矩陣見表4。由表3和4各特征向量值可知，第1主成分PC1主要反映C18:2的變異信息，故可將PC1命名為多不飽和脂肪酸因子F1。第2主成分PC2主要反映C18:1和C16:1的變異信息，故可將PC2命名為單不飽和脂肪酸因子F2。第3主成分PC3主要反映C16:0、C18:0、C22:0，C17:0、C14:0、C15:0和C24:0等的變異信息，故可將PC3命名為飽和脂肪酸因子F3。

2.4 腐乳脂肪酸組成比例綜合評價

由于PCA中前3個主成分反映了15個指標變量信息的98.711%，說明利用前3個主成分進行不同腐乳的游離脂肪酸的評價是可行的，可用F1（多飽和脂肪酸因子）、F2（單不飽和脂肪酸因子）、F3（飽和脂肪酸因子）3個新的綜合指標來替代原來的15個指標對腐乳脂肪酸進行分析，得到前3個主成分的線性關系式分別為：

主成分越重要，方差貢獻率越大，以每個主成分所對應的方差貢獻率為權重，構建綜合評價模型F=0.686F1+0.263F2+0.038F3，計算各樣品綜合得分，然后進行排序評價各個樣本的游離脂肪酸組成。得分如表5所示，游離脂肪酸組成比例分值排序為JS＞KS＞WS＞SS＞GS＞ZS＞RS＞CS，即醬腐乳＞克東腐乳＞白腐乳＞貴州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞紅腐乳＞白菜腐乳。說明不同游離脂肪酸綜合質量存在差異，JS腐乳的游離脂肪酸綜合質量最高。

表5 腐乳的成分得分和綜合得分Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of 8 sufu varieties

3 結論

不同腐乳中總游離脂肪酸差異顯著（P＜0.05），花色腐乳CS中總游離脂肪酸含量高達18.85 g/100 g，約為細菌型腐乳KS的2倍。GC-MS測定了8種腐乳中游離脂肪酸譜，共檢出15種游離脂肪酸，其中亞油酸、油酸和棕櫚酸為主要脂肪酸。PUFA/SFA比值最大的為KS（2.83），最小的為SS和RS，均為2.41。所有腐乳的PUFA/SFA比值遠遠高于推薦值0.45，說明腐乳的各脂肪酸比例合理，對健康具有重要意義。基于主成分分析法，提取得到的前三個主成分的貢獻率分別為68.626%、26.251%、3.834%，累計貢獻率達到98.711%，可較好反映所有游離脂肪酸組成的基本信息。根據建立的綜合評價模型可知游離脂肪酸組成比例分值排序為醬腐乳＞克東腐乳＞白腐乳＞貴州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞紅腐乳＞白菜腐乳。主成分分析法可有效對不同腐乳的游離脂肪酸組成比例進行綜合評價，但如果需要篩選出綜合品質好的腐乳品種，除了考慮脂肪酸的含量和比例之外，還需對其他營養素進行綜合分析，才能為腐乳生產工藝改善提供更為科學全面的依據。

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