酪酸菌MYS66發酵條件研究

李忠玲，張紅艷，傅 博，岳淑寧*

（1.陜西省生物農業研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術研究中心，陜西 西安 710043；3.中國科學院 西北生物農業中心，陜西 西安 710043）

酪酸菌即丁酸梭菌（Clostridium butyricum），存在于土壤、污泥、人和動物腸道以及干酪和自然發酵的酸奶、酒曲和窖泥中[1]。丁酸梭菌作為一種目前正被逐步廣泛使用的益生菌，已被許多研究證明能促進動物生長、促進乳酸菌等其它有益菌群的增殖、產生B族維生素、維生素K、丁酸等物質，并能在腸粘膜表面形成微生物屏障，阻止有害菌的定植和入侵，有效地改善腸道內微生態環境，調節腸道菌群微生態平衡，對宿主產生各種健康作用[2-3]。丁酸梭菌也能對一些腸道炎癥有治療效果，HAYASHI A等[4]研究發現，丁酸梭菌誘使腸道巨噬細胞增殖以抑制結腸炎。KANAI T等[5]運用待測序技術等手段表明，丁酸梭菌可作為益生菌誘發骨髓分化巨噬細胞在炎癥黏膜上通過Ⅱ型toll樣受體來抑制炎癥。除了能調節機體腸道菌落平衡，提高免疫力外，也有報道稱酪酸菌對肝臟損傷有治療和預防的效果[6]，而且還有研究表明酪酸菌對治療癌癥也有一定功效[7-8]。酪酸菌具有耐高溫、耐高壓、耐胃酸及耐膽鹽等生物學特性，并在畜禽生產中應用效果明顯。作為綠色新型活菌制劑，丁酸梭菌有著十分廣泛的研究前景。同時，有研究表明，酪酸菌還可用于制備丁酸、1,3-丙二醇[9-10]、酶制劑[11]等，隨著相關研究的深入，酪酸菌必將越來越多的造福人類。目前對于酪酸菌的進一步推廣應用，一方面需要更細化更系統地研究闡明其具體作用機制，另一方面則是其發酵工藝的優化。酪酸菌的相關報道中多以葡萄糖為碳源[12-14]，成本較高，本研究以玉米淀粉糖化液為碳源，對酪酸菌MYS66的發酵條件進行研究，為該菌工業生產提供基礎數據；并且研究了常用抗生素對該菌存活率影響，為其進一步的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酪酸菌（Clostridium butyricum）MYS66：初始菌種購自中國科學院微生物研究所，經陜西省生物農業研究所誘變篩選并編號保存。

1.1.2 培養基

種子培養基：蛋白胨5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0。115℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基：玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，NaCl 0.5g/L，pH 7.0。115℃滅菌20 min。

計數培養基：蛋白胨5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

K2HPO4·3H2O、KH2PO4（分析純）：廣西汕頭市西隴化工廠；MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2、NaCl（均為分析純）：西安化學試劑廠；胰蛋白胨、蛋白胨和酵母膏（均為生化試劑）：北京澳博星生物技術有限責任公司；硫酸粘桿菌素B：河南普華動物藥業有限公司；桿菌肽：美國Sigma公司；莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶：上海源葉生物科技有限公司；酒石酸泰樂菌素：徐州金牌藥業有限公司；液化酶、糖化酶：寧夏夏盛實業集團有限公司；玉米粉、豆粕粉均為市售。

1.2 儀器與設備

DV-650型桌上式（垂直送風）凈化工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；PYX-DHS-35X40-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；YX280蒸汽滅菌鍋：上海三中醫療器械有限公司；HH-W21-600-S電熱恒溫水溫箱：上海醫療器械七廠；PHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 種子活化

取-20℃甘油管保藏的菌種，以1%接種于裝有10 mL種子培養基的厭氧管中，37℃條件下靜態厭氧活化20 h。

1.3.2 種子培養

將活化的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL種子培養基的250mL厭氧瓶中。置培養箱中，37℃靜置培養20h。

1.3.3 玉米粉糖化液的制備

玉米粉20 g/L，添加0.5 mg/g原料的CaCl2，在80～85 ℃條件下添加10 U/g原料的液化酶，保溫至液化結束，液化終點用稀碘液檢測，稀碘液不變藍；將液化液升溫95～100℃保溫10 min進行滅酶，之后，降溫至55～60℃，調pH 4.5，添加300 U/g原料的糖化酶，保溫2 h。

1.3.4 培養方法

將生長好的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL發酵培養基的250 mL厭氧瓶中。置于培養箱中，靜置培養。

1.3.5 菌體濃度測定

采用平板活菌計數法：取培養結束的發酵液按10倍稀釋法稀釋成不同濃度稀釋液，分別吸取3種合適的稀釋液各0.1mL置于事先融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏、蛋白胨倒好的固體肉湯平板上，用無菌涂布棒涂均勻，每一個稀釋度涂3個平皿，涂完后倒置厭氧罐中37℃培養48h進行菌落計數。

1.3.6 芽孢計數方法

菌液于80℃，10 min熱處理殺滅營養體后，采用上述活菌計數法進行活菌計數，計算芽孢濃度，并以芽孢數與菌體濃度的比記為芽孢率。

1.3.7 發酵條件優化

以菌體濃度為評價指標，考察不同水平溫度、初始pH、接種量、無機鹽添加量對菌體濃度的影響，確定發酵參數。

1.3.8 抗生素添加方法

將相應抗生素按不同濃度過濾除菌后混入降溫至50℃的計數培養基，同時以不加抗生素的培養基做空白對照。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

將液體菌種按5%的接種量接于發酵培養基中，37℃條件下靜置培養32 h，定時取樣進行活菌計數，繪制生長曲線，結果見圖1。由圖1可知，該菌株在8 h達到生長對數期，18 h達到穩定期。

圖1 酪酸菌MYS66的生長曲線Fig.1 Growth curve ofClostridium butyricumMYS66

2.2 培養溫度對發酵的影響

溫度通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構與功能以及細胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的溫度會導致蛋白質或核酸的變性失活，過低的溫度會抑制酶活性，降低細胞的新陳代謝活動。分別在33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃條件下培養20h，觀察培養溫度對酪酸菌MYS66菌體濃度的影響，結果見圖2。由圖2可知，在溫度低于37℃時隨著溫度的升高菌體濃度有一定的增長，在37℃達到最大值，之后隨著溫度的提高菌體濃度呈下降趨勢。因此，確定酪酸菌MYS66的最適培養溫度為37℃。

圖2 培養溫度對酪酸菌MYS66生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of Clostridium butyricumMYS66

2.3 初始pH值對酪酸菌MYS66生長的影響

pH可通過影響蛋白質等生物大分子所帶電荷的變化引起細胞膜電荷變化，導致微生物細胞吸收營養物質能力改變，因此培養基的pH對微生物的生長有重要影響。試驗將初始pH設為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，37℃條件下靜置培養20 h，進行活菌計數，考察pH對菌株MYS66生長的影響，結果見圖3。由圖3可知，菌體濃度隨著初始pH的升高有一定的增長，在初始pH為7.2時達到最大，之后隨著初始pH的升高呈下降趨勢，因此，確定酪酸菌MYS66的最適初始pH為7.2。在整體變化趨勢上，初始pH在7.0～7.6比較平穩，說明此區間是該菌的耐受范圍，在此區間之外菌體濃度下降趨勢明顯。

圖3 初始pH對酪酸菌MYS66生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.4 接種量對酪酸菌MYS66生長的影響

接種量的大小決定生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短延滯期，減少雜菌的生長機會。但接種量過大會因前期營養消耗過快而使最終菌體濃度降低，同時，接種量過大會移入過多代謝廢物，也不經濟；相反，接種量過小會延長培養時間，降低發酵的生產效率。試驗分別采用2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%的接種量，37℃靜置培養20 h，進行活菌計數，結果見圖4。由圖4可知，菌體濃度隨著接種量的增大而增加，在接種量為4%時達到最大值，之后隨著接種量的增大菌體濃度呈下降趨勢。因此，確定酪酸菌MYS66的最適接種量為4%。

圖4 接種量對酪酸菌MYS66生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.5 無機鹽對生長的影響

某些金屬離子可促進菌體生長（如K+、Ca2+和Mg2+等）；也有報道稱添加適量CO32-可緩沖酸度變化，并且釋放出的CO2有助于芽孢生成[15]。該試驗主要研究了K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2和NaCl添加量對發酵的影響，各無機鹽單因素試驗設計見表1。培養條件為初始pH7.2，37℃靜置培養20h，進行活菌計數。試驗結果見圖5。

表1 無機鹽優化單因素試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiments for inorganic salt optimization

由表1和圖5可知，各無機鹽最佳添加量分別為：KH2PO41.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L。

經過以上試驗，得到了最佳培養條件和各無機鹽單因素最佳添加量，并以此條件進行發酵試驗，即將培養基組成優化為玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏6 g/L，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0g/L，CaCl20.2g/L，NaCl1.0g/L，在pH7.2，接種量4%，37℃的條件下靜置培養20h，此時菌體濃度達到2.66×108CFU/mL。

圖5 無機鹽對酪酸菌MYS66生長的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.6 50 L發酵罐發酵

以優化的條件進行50 L發酵罐發酵試驗，即50 L發酵罐，優化后的培養基裝料量35 L，接種量4%，37℃靜置發酵32 h，測菌體濃度，芽孢濃度，計算芽孢率，結果見圖6。經50L發酵罐發酵，在發酵32h，菌體濃度為2.64×108CFU/mL，芽孢濃度達到2.49×108CFU/mL，芽孢率達到94.3%。

圖6 酪酸菌MYS66在50 L發酵罐中的生長情況Fig.6 Growth ofClostridium butyricumMYS66 in 50 L fermenter

2.7 幾種常用抗生素對酪酸菌存活率的影響

大量試驗證明，將益生素分別與抗生素、寡糖、酸化劑、中草藥、肽等合理配伍表現出了理想的使用效果[16]。在生產中因動物防病和治病的需要可能會使用某些抗生素類藥物，這些藥物也許會對飼用益生菌酪酸菌MYS66的生長產生影響，因此研究常用抗生素對該菌的影響非常必要，希望對其在養殖業中的應用有所幫助。主要研究了硫酸粘桿菌素B、桿菌肽、莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶、酒石酸泰樂菌素8種抗生素對酪酸菌MYS66存活率的影響，結果見圖7。

圖7 幾種常用抗生素對酪酸菌MYS66存活率的影響Fig.7 Effects of several common antibiotics on the survival rate of Clostridium butyricumMYS66

由圖7可知，各抗生素對酪酸菌存活率的影響由低到高的順序為硫酸粘桿菌素B＜莫能霉素鈉＜鹽酸林可霉素＜酒石酸泰樂菌素＜桿菌肽＜磺胺嘧啶＜新霉素硫酸鹽＜鹽酸金霉素。

3 結論

通過對酪酸菌發酵條件的研究，得到了最佳發酵培養基組成為玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏6g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L；確定最佳發酵條件為初始pH 7.2，培養溫度37.0℃，接種量4%。經50L發酵罐發酵32h時，菌體濃度為2.64×108CFU/mL，芽孢濃度為2.49×108CFU/mL，芽孢率達到94.3%。通過常用抗生素對該菌存活率影響的研究，結果表明：各抗生素對酪酸菌存活率影響由低到高的順序為硫酸粘桿菌素B＜莫能霉素鈉＜鹽酸林可霉素＜酒石酸泰樂菌素＜桿菌肽＜磺胺嘧啶＜新霉素硫酸鹽＜鹽酸金霉素。以上研究結果為酪酸菌MYS66進一步生產及應用提供了基礎數據。

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