副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的響應面優化

陳 辰，朱潤琪，劉 麗，馬 軒，葉曉婉，楊增光，席 宇，朱大恒*

（1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.華中科技大學 藥學院，湖北武漢 430074；3.北京諾禾致源科技股份有限公司，北京 301700）

作為一種重要的化工原料，L-乳酸在食品、紡織、化工、釀造、醫藥等行業的應用十分廣泛[1-4]。由乳酸單體聚合而成的聚L-乳酸[5-7]可作為一種可用于制造綠色無污染的可降解塑料等材料，具有良好的應用潛力和社會效益。目前L-乳酸的生產方法主要有化學法和發酵法，鑒于化學法對環境造成的污染較大，目前已逐漸被環保、高效、清潔的微生物發酵法所代替[8]，發酵產L-乳酸的微生物主要有乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和根霉菌屬（Rhizopussp.）[9-11]，其中LAB是目前L-乳酸發酵的主要微生物類群。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是近年來引起關注的一類乳酸菌，劉云[12]用副干酪乳桿菌HD1.7在MRS培養基上發酵產L-乳酸，產量達到90 g/L。魏敏等[13]對副干酪乳桿菌耐受乳酸能力的研究，發現菌株可以在高濃度乳酸溶液中達到極高的活菌濃度。

尋找合適的廢棄物或者廉價底料發酵產L-乳酸[14-17]，不僅能夠降低污染[18]，實現資源的回收再利用，而且進一步降低了生產成本，已成為當前的熱點領域。RUENGRUGLIKITC等[19]將玉米芯等農業有機廢料作為發酵底料，利用乳酸菌作為發酵菌株，結果表明，乳酸的產率可達到300 g/kg。JINB等[20]利用少根根霉（Rhizopusarrhizus）DAR36017發酵玉米和土豆淀粉廢水產乳酸，結果表明，乳酸產量為19.5～44.3g/L。MIURAS等[21]用Bacillussp.與Rhizopussp.MK-96-1196混合培養，直接發酵未經預處理的米糠等粗原料，結果表明，在100 g/L的粗原料中乳酸產量為24 g/L。在卷煙加工[22-24]、煙草薄片生產[25-28]過程中，均有大量富含可溶性糖、含氮化合物和礦物質等成分[29-32]的高濃度煙草廢水產生，具有潛在資源化利用價值。

目前利用煙草廢水發酵制備L-乳酸的研究尚未見其他實驗室報道[33-34]，因此，利用副干酪乳桿菌發酵煙草廢棄物制備L-乳酸具有巨大的開發潛力。本研究以分離鑒定的一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）ZG19為出發菌株，對菌株ZG19發酵煙草廢水產乳酸的工藝條件進行優化，旨在為副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水規模化制備L-乳酸和煙草廢水的資源化綜合利用提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

煙梗（直徑為0.30～0.50 cm，長度為4.0～5.0 cm）：天昌國際煙草有限公司。副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）ZG19：由本實驗室分離并保存。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；酵母粉：英國OXOID公司；蛋白胨：鄭州創生生物科技公司；吐溫80（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；葡萄糖、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；瓊脂粉：美國Sanland公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，檸檬酸三銨2g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-801mL，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，瓊脂1.8%。

液體種子培養基：同MRS培養基，不加瓊脂即可。

發酵培養基采用模擬煙草廢水培養基[35]：煙梗60℃烘干至恒質量后用粉碎機粉碎成粉末狀，取30 g煙梗粉末放入500 mL三角瓶，加入300 mL的蒸餾水（100℃），180 r/min振蕩30 min后抽濾，濾液即為模擬煙草廢水培養基。

1.2 儀器與設備

SYQ-DS2X-280B高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；HZQ-X100恒溫振蕩培養箱：太倉市實驗設備廠；GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；101型電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；MP200A電子天平：上海精科天平儀器廠；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；PHS-3C精密pH計：上海鵬順科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

從MRS斜面培養基上挑取副干酪乳桿菌ZG19菌種，接入裝液量為100 mL/250 mL液體種子培養基中，37℃、180 r/min培養14 h。

1.3.2 Plackett-Burman試驗設計

選用N=12的Plackett-Burman（PB）設計對初選的影響ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的7種相關因素：發酵溫度、發酵液初始pH、發酵時間、裝液量、接種量、CaCO3含量、發酵方式進行考察分析，以L-乳酸產量為響應值，每種因素取高（+）、低（-）兩個水平，并余出4個空白項作為誤差分析，高水平倍數不超過低水平2倍，因素之間間隔分布，7種因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.3 最陡爬坡試驗設計

根據PB試驗選取對L-乳酸產量影響最顯著的3個因素：發酵溫度、發酵時間和接種量進行最陡爬坡試驗，由于這3個因素對白僵菌孢子產量都有明顯的正效應，因此將其含量逐漸增加以此來尋找最佳響應區域，而發酵方式具有明顯的負效應，所以采用靜置發酵方式。根據PB試驗結果設定變化方向與步長，具體設計如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗設計Table 2 Design of the steepest ascent experiments

1.3.4 Box-Behnken響應面試驗設計

本試驗主要采用Box-Behnken設計方法來進行發酵條件優化。通過Plackett-Burman試驗確定發酵過程中影響L-乳酸產量的3個主要因素：發酵溫度（A）、發酵時間（B）和接種量（C），進一步設計爬坡試驗逼近最優條件附近，設計Box-Behnken試驗進行3因素3水平響應面優化分析，各因素與水平取值見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 數據處理

每個處理設置3個重復，采用Design-Expert 8.0.6進行數據統計和分析。

2 結果與分析

2.1 PB試驗結果

2.1.1 Plackett-Burman設計及結果

根據表1選取的7個因素和水平進行PB試驗，具體設計及結果見表4。從表4可以看出，L-乳酸產量響應值最小值為2.28 g/L，最大值為8.59 g/L，變化幅度較大，差別明顯，表明所選因素的改變對L-乳酸的產量有顯著影響。

表4 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.1.2 PB試驗各因素效應分析

各因素的影響度和模型貢獻率如表5所示。影響度是指模型中的某個因素從低水平（-1）向高水平（+1）變化時對模型響應值所產生的影響，其中負值表示該因素對響應值具有負效應，并且影響度值越大說明該影響因子對響應值的影響越顯著[36]。貢獻率是指模型中某因素的平方和占模型中各因素平方和的總和的百分比，其值大小表明了該因素對響應值影響程度的大小，貢獻度越大表明該因素變量在模型中的作用越大[37]。從表5可看出，不同因素差別很大，其中接種量的影響度和貢獻率均最高，分別為1.83和34.87%，其次為發酵溫度，影響度和貢獻率分別為1.50和23.34%，時間對L-乳酸產量的影響僅次于接種量和溫度。接種量影響發酵延滯期的時間[38]，發酵溫度對菌株的生長和發酵具有重要作用，發酵時間則會影響發酵產物的積累。此外，發酵方式對L-乳酸的產生積累具有明顯的負效應，表明菌株ZG19發酵產乳酸是一個厭氧過程，增加轉速導致發酵液溶氧增加，抑制乳酸的合成。

表5 Plackett-Burman試驗因素效應分析Table 5 Factors effect analysis of Plackett-Burman experiments

2.1.3 PB試驗結果方差分析

對PB試驗結果進行方差分析，結果見表6。P值表示樣本間差異的顯著性水平，P＜0.05表明樣本之間具有顯著差異，P＜0.01表明樣本間的差異極顯著。由表6可知，本模型的P＜0.001，表明該模型高度顯著，在整個回歸區域里擬合度良好，具有實際意義，可用來評估各個因素對L-乳酸產量的影響。在所選取的因素中，發酵溫度、初始pH、發酵時間、接種量的P值均小于0.01，表明這些因素對ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸都有極其顯著的影響，其中發酵溫度、初始pH、發酵時間、接種量具有顯著的正效應，發酵方式則具有顯著的負效應，具有統計學意義。

根據各因素影響度、貢獻率和方差分析綜合評價，確定發酵溫度、發酵時間、接種量為副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的主要正效應因子，發酵方式為主要負效應因子。因此，在后續試驗中采取靜置發酵方式，并對發酵溫度、發酵時間和接種量做進一步優化。

表6 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡試驗結果

根據PB試驗結果，對菌株ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸影響最顯著的3個正效應因素：發酵溫度、發酵時間、接種量設計最陡爬坡試驗，結果如圖1所示。

圖1 最陡爬坡試驗結果Fig.1 Results of the steepest ascent experiments

由圖1可知，隨著發酵溫度、發酵時間和接種量的增加，L-乳酸產量逐漸升高，并且不同試驗組對L-乳酸產量影響顯著（P＜0.05）。在發酵溫度38℃，發酵時間32 h，接種量（第5組）10%時，L-乳酸產量達到最大值。因此，選取此條件為中心點，每個因素取3水平，以（-l，0，1）編碼，設計Box-Behnken響應面試驗，以篩選出發酵溫度、發酵時間和接種量的最優配比。

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計結果及方差分析

對選取的3種主要效應因素發酵溫度（A）、發酵時間（B）和接種量（C）進行Box-Behnken試驗設計，響應值為L-乳酸產量（Y），設置17個試驗點，其中12個試驗點為析因點，其余5個試驗點為零點，結果見表7。

以L-乳酸產量作為響應值，根據表7中Box-Behnken試驗設計及結果，進行二次回歸分析，得到回歸方程為Y=-460.50000+9.37500A+5.90625B+40.62500C-0.03125AB+0.125 0AC+0.0109 2BC-0.1250 0A2-0.0781 25B2-2.25C2。對回歸方程各項進行方差分析，結果見表8。從表8可以看出，模型的P值＜0.000 1，說明此模型具有極高的顯著性，并且經過校正后回歸方程決定系數R2Adj為98.69%，表明方程的擬合度良好，變異系數為1.44%，值較小，表明試驗結果可靠。

表7 Box-Behnken試驗設計及結果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of the regression model

2.3.2 響應面分析及最佳發酵條件的確定

根據回歸方程繪制響應面和等高線圖，結果如圖2所示，從圖2可以看出，發酵溫度、發酵時間的交互作用以及發酵溫度、接種量的交互作用明顯，而發酵時間和接種量之間的交互作用不明顯。從響應面圖和模型分析可知回歸方程存在最大值，得到最優條件為：發酵溫度38.80℃，發酵時間30.04 h，接種量10.11%時，L-乳酸產量理論最優值為15.35 g/L。

圖2 發酵溫度、發酵時間和接種量相互作用對L-乳酸產量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on L-lactic acid yield

2.3.3 模型驗證

通過Box-Behnken響應面優化得到副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的最佳發酵條件為：發酵溫度38.80℃，發酵時間30.04 h，接種量10.11%時，L-乳酸產量理論最優值為15.35 g/L。為方便實際操作，在發酵溫度39℃，發酵時間30 h，接種量10%條件下進行驗證試驗，得到實際L-乳酸產量為15.16 g/L（3次重復平均值），與模型預測值擬合度達到98.76%，表明通過響應面法對副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸工藝條件的優化合理而有效，具有實際意義。

3 結論

通過響應面優化試驗，得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的最佳工藝條件為發酵溫度39℃，發酵時間30 h，接種量10%時，靜置發酵，實際L-乳酸產量為15.16 g/L，與模型預測最優值（15.35 g/L）擬合度達到98.76%，相比PB試驗L-乳酸產量顯著提高達到了76.5%。本研究探究并優化了副干酪乳桿菌ZG19發酵煙草廢水產L-乳酸的發酵工藝，顯著提高了L-乳酸產量，具有良好的開發潛力和應用價值，為煙草廢水、煙草廢料的資源化利用開辟了新途徑。

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