赤霞珠葡萄酒釀造過程中花色苷及顏色參數變化規律

葛 謙，劉正庭，陳 翔，張鋒鋒，牛 艷，楊 靜，吳 燕*

（1.寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002；2.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

顏色作為葡萄酒品質評價最重要的指標之一，蘊含了葡萄酒的產地、品種、釀造工藝、陳釀時間酒齡，甚至葡萄酒缺陷等信息[1-4]。花色苷作為葡萄酒主要呈色物質，主要存在于紅色、紫色葡萄漿果皮中最靠近表皮3～4層細胞的液泡中[5-7]，使其呈現出紅色、磚紅色、紫紅色等不同顏色[8-10]。在自然界中，花色苷常以糖苷形式穩定存在，主要有5種花色苷（anthocyanidin）形成的糖苷及其衍生物：花青素（cyanidin）、花翠素（delphindin）、甲基花青素（peonidin）、甲基花翠素（petunidin）和二甲花翠素（malvidin）[11-12]。花色苷具有重要的生物活性，對人類具有許多生理保健功能，如消除自由基、抗炎、抗癌、抗腫瘤、保護肝臟、美容以及減肥等，在藥品和化妝品方面都具有廣泛的應用[13]。

葡萄酒釀造過程中顏色的變化始終是葡萄酒學關注的焦點，關系著葡萄酒釀造工藝的質量控制、貯藏階段的顏色品質的穩定性以及葡萄酒風格特色。HANFL等[14]采用主成分回歸（principalcomponentregression，PCR）分析方法得到結果：赤霞珠葡萄酒中參與分析的花色苷顏色占新鮮葡萄酒紅色色調的64.56%～81.57%。葡萄酒中花色苷主要以游離、結合以及聚合的狀態存在，其中游離態花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，儲存的前幾年便與其他物質結合而消失，結合態及聚合態花色苷受酒齡影響較小[2，15-16]。在葡萄酒釀造過程中，發酵初期葡萄皮中部分單體花色苷通過浸漬作用進入葡萄酒汁液中，顏色呈鮮紅色，隨著發酵作用的進行，單體花色苷逐漸聚合為聚合花色苷使其呈磚紅色[17-21]。

花色苷的含量及組成在葡萄酒釀造和陳釀過程中變化極其復雜，目前對顏色的表述有葡萄酒顏色（wine color，WC）包括了已被氧化的不穩定花色苷，總色素（totalcolorof pigments，WCA）包括了離子化的花色苷，聚合色素（polymericpigmentcolor，PPC）是花色苷和其他酚類物質發生聚合反應生成的色素，對葡萄酒起穩定作用[22]。本研究以賀蘭山東麓赤霞珠葡萄酒為研究對象，分析了不同品種葡萄酒在釀造過程中花色苷6種主要組分的變化規律，并輔以色度、色調、感官評價WC、WCA、PPC等指標，初步評價了葡萄酒釀造過程中變化規律及其相關性，為葡萄酒釀造工藝改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄：寧夏銀川永寧赤霞珠（CabernetSauvignon）。6種花色苷標準品：美國Chromadex公司，詳細信息見表1。

表1 花色苷標準樣品信息Table 1 Information of anthocyanins standard sample

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WLS21：保存于西北農林科技大學食品科學與工程學院食品發酵工程與食品安全控制實驗室。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；鹽酸（優級純）：上海化學試劑有限公司；檸檬酸、果膠酶、偏重亞硫酸鉀、磷酸氫二鈉、三水醋酸鈉、氯化鉀（分析純）：北京為民生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀（配2475紫外檢測器及Xcalibur1.2數據處理系統）：美國Waters公司；凱航HH-8數顯恒溫水浴鍋：常州市凱航儀器有限公司；FRQ-1006單槽超聲波清洗機：杭州法蘭特超聲波科技有限公司；Mili-Q型超純水機：美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：釀酒葡萄原料取5 kg除梗破碎入罐（10 L棕色玻璃罐），添加果膠酶40mg/L，偏重亞硫酸鉀100mg/L，于13～15℃條件下浸漬3d后，添加釀酒酵母WLS21（200mg/L），于25～28℃條件下進行酒精發酵，當總糖含量＜4 g/L時進行皮渣分離，進入蘋果酸乳酸發酵，溫度控制在（20±2）℃。蘋果酸乳酸發酵結束后，（4±2）℃低溫保藏。取樣品期間，做3個重復，每次將葡萄酒搖勻取20mL，進行顏色指標的監測。

1.3.2 游離花色素苷采用示差法[23]

用移液管吸取2 mL樣品液，分別用pH1.0（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，V/V）和pH4.5（0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc=1∶1，V/V）的緩沖液稀釋至20 mL，混勻。以2 mL蒸餾水加18 mL相應緩沖液作空白，測定波長510 nm處的吸光度值。

游離花色苷的含量（二甲花翠素葡萄糖苷）計按公式（1）、（2）計算：

式中：A為吸光度值；26 900為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數；449.12為二甲花翠素3-O-葡萄糖苷的物質的量，g/mol。

1.3.3 葡萄酒色度、色調的測定[23]

將葡萄酒過4.5 μm濾膜，測定其pH。用相同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，于1 cm比色皿中，測定波長420 nm、520 nm、620 nm處的吸光度值，三者之和的10倍為葡萄酒的色度。420 nm/520 nm為色調。

1.3.4 WC、WCA、PPC的測定[24]

WC的測定：將40 μL乙醛加入4 mL酒樣中，45 min后測定波長520 nm處的吸光度值。

WCA的測定：將9 mL 0.1 mol/L鹽酸加入1 mL酒樣中，4～5 h后測定波長520 nm處的吸光度值。

PPC的測定：將15 mg NaHSO3加入5 mL酒樣中，1 min后測定波長520 nm處的吸光度值。

1.3.5 6種花色苷的測定[25]

前處理方法：稱取5.00 g葡萄酒于150 mL三角瓶中，加入無水乙醇∶鹽酸∶水（2∶1∶1，V/V）提取劑25 mL，搖勻，超聲30 min后，于100℃沸水浴冷凝回流1 h。取出樣品冷卻至室溫，經0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。釀酒葡萄樣品稱取10.00 g，前處理方法同葡萄酒。

色譜條件為色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：40℃；檢測波長：525 nm；流動相：A乙腈；B 0.1%磷酸水溶液；流速：0.8 mL/min，梯度洗脫；進樣體積：5 μL，0～25 min，乙腈10%～25%；25～27 min，乙腈25%～10%；流速為0.8 mL/min。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段6種花色苷組分及含量變化規律

在赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏過程中，監測葡萄酒中花色苷組分及含量變化規律，結果見表2。由表2可知，在釀酒葡萄壓榨成葡萄汁入罐前，Pt未檢出，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的6.66%、10.79%、6.81%、16.99%、57.92%；在第26天酒精發酵階段結束，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的14.84%、14.77%、6.54%、6.57%、46.24%；在第36天蘋果酸-乳酸發酵階段結束，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的17.26%、17.63%、7.98%、6.50%、56.41%。由此可知，花色苷各組分在總花色苷含量所占比例中，Mv占46.24%～57.92%，變化不明顯，是葡萄汁及葡萄酒主要花色苷組分；Dp、Cy、Pg呈上升趨勢，Pn呈下降趨勢，說明在葡萄酒釀造過程中花色苷不同組分存在著相互轉化關系[26]；與此同時，Cy、Pg、Pn、Mv、ACY在入罐前第1天含量最低，分別為1.41 mg/kg、0.89mg/kg、2.22mg/kg、7.57mg/kg、13.07mg/kg；Dp在第3天最低，為0.87 mg/kg；Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY分別在第28天（75.67mg/kg）、第28天（83.43 mg/kg）、第36天（30.89 mg/kg）、第36天（30.20 mg/kg）、第17天（218.81 mg/kg）、第28天（423.4 mg/kg）時含量達到最高。在貯藏階段（65～154 d），花色苷各組分呈波浪形遞減趨勢，說明葡萄酒酒精發酵及蘋果酸乳酸發酵過程中有利于葡萄酒花色苷的富集，且在蘋果酸乳酸完成時各花色苷含量均達到最高，在貯藏階段略有下降，可能與貯藏條件（溫度、微氧等）有關，后續還需進一步深入研究。PECHAMAT L等[27]認為溫度、光、氧氣對葡萄酒的顏色影響很大。在葡萄酒生產過程中，酚類物質的降解，是由于葡萄酒與空氣接觸所引起的酚類物質的氧化造成的。

表2 赤霞珠葡萄酒釀造過程中花色苷變化規律(n=3)Table 2 Change rules of anthocyanins in the brewing process of Cabernet Sauvignon wine

2.2 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段顏色參數變化規律

表3 赤霞珠葡萄酒釀造過程中顏色參數變化規律(n=3)Table 3 Change rule of color parameters in the brewing process of Cabernet Sauvignon wine

在赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏過程中，監測葡萄酒中顏色參數變化規律，結果見表3。由表3可知，色度、色調、PPC、WCA、WC在第1天（葡萄汁）均最低，分別為2.78、0.43、0.18、0.35、1.20，在26 d、96 d、109 d、20 d、26 d時含量達到最高，分別為17.86、0.65、10.23、2.57、3.26。色度、色調、PPC、WCA、WC在葡萄酒釀造及貯藏過程中均程序先上升后下降的趨勢，說明葡萄酒在釀造過程中對酒體的顏色有促進作用，隨著時間的增長，在貯藏階段程序小幅度的下降，這和日常對葡萄酒釀造及貯藏階段感官認知方面的顏色變化相一致。色度[28]代表著對葡萄酒顏色深淺的感知，色調是對葡萄酒一系列各種各樣的顏色及不同的組合的感知。在整個釀造及貯藏階段，色度變化幅度較大（2.78～17.86），色調變化幅度較小（0.43～0.65），說明在酚類物質、酵母菌、pH等綜合因素的影響下，葡萄酒顏色由淺變深，而各顏色之間的變化不很明顯。聚合色素（PPC）是花色苷和其他酚類物質發生聚合反應生成的色素，對葡萄酒顏色起到穩定性作用。在葡萄酒釀造及貯藏階段，葡萄酒PPC由0.18（第1天）呈波浪形遞增趨勢，在第17d、20d達到10.00，在第109天達到最高值10.23，在第109～154 d穩定在9.35～10.23，說明葡萄酒釀造過程中花色苷由單體花色苷慢慢形成聚合花色苷，在貯藏階段達到穩定且保持著較高的聚合度，這對葡萄酒貯藏階段的穩定性起著關鍵作用。這與韓富亮等人研究結果相一致：葡萄酒中花色苷主要以游離、結合以及聚合的狀態存在，其中游離態花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，儲存的前幾年便與其他物質結合而消失，結合態及聚合態花色苷受酒齡影響較小[2，18，22]。葡萄酒顏色（WC）包括了易被氧化的不穩定的花色苷，總色素（WCA）包括了離子化的花色苷，在整個釀造及貯藏階段呈波浪形先上升后下降的趨勢，變化幅度較小，分別為1.20～3.26、0.35～2.57，這和葡萄酒色度、色調以及花色苷主要組分變化規律相一致。有研究表明，花色苷在葡萄酒的釀造過程和貯藏過程中不斷變化，葡萄酒的顏色也相應地發生變化，隨著基本花色苷和酰化花色苷的減少，吡喃花色苷和聚合花色苷的增多，葡萄酒的顏色由鮮艷的紅色逐漸變為陳釀酒的磚紅色等顏色[2，4，22，28]。

2.3 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段各顏色參數之間的相關性分析

表4 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階各顏色參數之間的相關性分析Table 4 Correlation analysis of color parameters in the Cabernet Sauvignon wine during brewing and storage stages

對赤霞珠葡萄酒釀造過程中花色苷各組分及顏色參數進行相關性分析，結果見表4。由表4可知，赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏階段顏色參數之間表現出了很好的相關性，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY、色度、WCA、WC之間均呈極顯著正相關（P＜0.01），與色調不相關，PPC與色調和葡萄酒顏色呈顯著正相關（P＜0.05）。

3 結論

本試驗研究了赤霞珠紅葡萄酒釀造和貯過程中，葡萄酒中花色苷各組分及顏色參數變化規律及相關性，結果表明，在葡萄酒釀制和貯藏階段，不同品種葡萄酒花色苷各組分均呈現先上升，在蘋果酸乳酸發酵階段結束前達到最高而后開始呈下降趨勢，在貯藏階段后期趨于穩定。Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY、色度、WCA、WC之間均呈極顯著正相關（P＜0.01），與色調不相關。PPC與色調和WC呈顯著正相關（P＜0.05）。Dp、Cy占ACY的比例均呈波浪形遞增趨勢，Pt、Pg、Mv占ACY的比例變化不明顯，維持動態穩定的趨勢，Pn占ACY的比例均呈波浪形遞減趨勢。葡萄酒酒精發酵及蘋果酸乳酸發酵有利于葡萄酒花色苷的富集，且在蘋果酸乳酸完成時各花色苷含量均達到最高，在貯藏階段略有下降，可能與貯藏條件（溫度、微氧等）有關，后續還需進一步深入研究。本試驗在前人的基礎上研究了赤霞珠釀酒葡萄釀造過程和貯藏過程花色苷組分及含量變化規律的研究，這為葡萄酒釀造工藝的質量控制提供了理論依據，為葡萄酒顏色穩定性及品質評價提供了重要的科學依據。

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