根皮苷生物轉化制備根皮素工藝優化研究

汪瑾雨，余海立，劉蘭慶，蘇香萍，汪鋆植，2*

（1.三峽大學 生物與制藥學院 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌443002；2.湖北省土家族醫藥研究所，湖北 宜昌 443002）

根皮素是根皮苷的脫糖基產物，存在于蔬菜，蘋果、梨等水果中，是著名的天然二氫查爾酮之一[1-3]，具有抗氧化[4]、抑制酪氨酸酶活性[5-6]、抗癌[7-8]、抗炎[9]、抗菌[10]和雌激素作用[11]等多種生物活性[12]。近年來，根皮素作為抗氧化功效因子在食品領域應用廣泛，李姝靜等[13]制備出根皮素與β-環糊精的包合物，提高了根皮素的水溶性和抗氧化能力，有利于其加工成水基化保健食品劑型。孫玥等[14]采用等效面分析法考察了多組分食品添加劑—阿魏酸、根皮素和水溶性維生素E（vitamin E，VE）抗氧化的協同作用，并進行配方比例的響應面優化；此外，還制備出阿魏酸、根皮素及水溶性維生素E（VE）的復方微乳[15]，提高了復方抗氧化體系的穩定性和抗氧化效力，擴大了其在食品、化妝品等領域的應用。ZHANG T J等[16]用不同溶劑提取蘋果渣并測定其活性，證實了根皮素可作為合成抗氧化、抗菌食品添加劑的天然替代品。然而，根皮素在植物中的含量較低[17]，而根皮苷易于從蘋果、海棠等植物中大量獲取，因此，利用根皮苷制備根皮素是一條可行途徑[18-20]。為了更高效、環保地生產根皮素，本研究利用酵母菌生物轉化根皮苷制備根皮素，并通過響應面法優化出根皮苷最佳轉化工藝，以期為根皮素工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；根皮苷標準品（純度≥98%）、根皮素標準品（純度≥98%）：上海純優生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Tedia有限公司；其余試劑均為國產分析純。

發酵培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HH-6數顯恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭實驗儀器廠；ME215S型十萬分之一電子天平：德國Sartorios公司；Dionex U 3000型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）：美國戴安液相色譜有限公司；JY99-IIDN型超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；HEV-50型自動滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SB-100旋轉蒸發儀：日本EYELA公司；0.45 μm尼龍膜針筒過濾器：天津津騰實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母轉化液收集

取斜面菌種接種至200 mL發酵培養基中，于30℃、100 r/min條件下，培養24 h，制得種子液。以5%的接種量吸取種子液至200 mL發酵培養基中，于30℃、100 r/min條件下，培養48 h后，于2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀細胞。沉淀細胞用同等體積的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液淋洗兩遍，置于三角燒瓶中，在冰浴條件下破碎（破碎3 s，間歇3 s，共70次，10 min），即得酵母轉化液。

1.3.2 根皮苷的生物轉化方法

實驗組：取上述一定體積的轉化液，pH自然，加入合適比例的一定濃度的根皮苷溶液，于適宜溫度下水浴相應時間，沸水加熱5 min，以終止反應。轉化液用同等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，于45℃減壓蒸干，用甲醇溶解，并定容至一定體積，0.45 μm的微孔濾膜過濾。采用HPLC分析濾液中的根皮素，并根據根皮素標準曲線回歸方程計算含量。實驗中，同時設立對照組，即只加轉化液，不加底物。根皮素產率按如下公式計算：

式中：C1為轉化液中根皮素的質量濃度，g/L；C2為底物根皮苷的質量濃度，g/L；M1為根皮素的相對分子質量，274.27；M2為根皮苷的相對分子質量，436.41。

1.3.3 高效液相色譜分析

色譜條件：CosmailC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（55∶45，V/V）；檢測波長為285 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.3.4 根皮素標準曲線的繪制

精密稱取0.01g的根皮素標準品，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，即得質量濃度為1.0 g/L的根皮素標準品溶液。精密吸取標準溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配成質量濃度為10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的系列根皮素標準溶液。吸取10 μL，于上述色譜條件下進樣分析，每個質量濃度進樣3次，計算平均峰面積。以根皮素質量濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得根皮素標準回歸方程為：Y=0.459 2X-1.325（R2=0.999 5）。根據根皮素標準回歸方程計算樣品中根皮素含量。

1.3.5 單因素試驗

選取轉化時間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h）、轉化溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、酵母轉化液與底物根皮苷體積比（液料比）（5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1（V/V））和底物根皮苷質量濃度（8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、16 g/L）對根皮素產率的影響，以確定響應面試驗的考察因素及各因素的水平。

1.3.6 響應面試驗[21-22]

根據單因素試驗結果，選擇轉化時間（X1）、轉化溫度（X2）、液料比（X3）為考察因素，以根皮素產率（Y）為評價指標，按照Box-BehnkenDesign（BBD）試驗設計，進行3因素3水平響應面分析試驗，數據分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，從而得出生物轉化制備根皮素的最佳條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 根皮素制備條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for phloretin preparation conditions optimization

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 轉化時間對根皮素產率的影響

圖1 轉化時間對根皮素產率的影響Fig.1 Effect of conversion time on the yield of phloretin

轉化時間對根皮素產率的影響見圖1。由圖1可知，隨著轉化時間的延長，根皮素產率也逐漸增加，當轉化時間為18 h時，根皮素產率最高，為49.75%。若轉化時間太短，底物根皮苷轉化不完全；轉化時間過長，轉化液中酶失活。因此，選取轉化時間16 h、18 h、20 h為響應面試驗的取值范圍。

2.1.2 轉化溫度對根皮素產率的影響

轉化溫度對根皮素產率的影響見圖2。由圖2可知，隨著轉化溫度的升高，根皮素產率先增加后減少，當轉化溫度為40℃時，產率達最大，為48.67%；當轉化溫度在30℃～40℃時，根皮素產率隨著轉化溫度的升高而緩慢增加；當轉化溫度高于40℃后，隨著轉化溫度的升高，根皮素產率呈下降趨勢。其原因可能是溫度過高，轉化液中酶失活且失活速率也加快所致。因此，選取轉化溫度30℃、40℃、50℃為響應面試驗的取值范圍。

圖2 轉化溫度對根皮素產率的影響Fig.2 Effect of conversion temperature on the yield of phloretin

2.1.3 液料比對根皮素產率的影響

液料比對根皮素產率的影響見圖3。由圖3可知，隨著液料比的增加，根皮素產率逐漸增加，液料比為11∶1（V/V）時產率最大且趨于穩定，為70.05%。說明在底物根皮苷的量一定的情況下，液料比達到11∶1（V/V）后，根皮素產率基本保持不變，此后無增加液料比的必要。因此，選取液料比9∶1、11∶1、13∶1（V/V）為響應面試驗的取值范圍。

圖3 液料比對根皮素產率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on the yield of phloretin

2.1.4 底物質量濃度對根皮素產率的影響

底物質量濃度對根皮素產率的影響見圖4。由圖4可知，隨著底物質量濃度的增加，根皮素產率也逐漸增加，但整體增加幅度相對較小，底物質量濃度在10 g/L時產率最大，為69.55%。這是因為轉化液中酶的耐受能力與底物質量濃度有關，同時產物根皮素的積累也會對轉化液中的酶產生抑制。底物質量濃度為8 g/L時的產率（66.21%）與底物質量濃度為10 g/L時的產率（69.55%）差異不大，且此后，繼續增加底物質量濃度，根皮素產率變化不明顯。

圖4 底物質量濃度對根皮素轉化率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the yield of phloretin

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以轉化時間（X1）、轉化溫度（X2）、液料比（X3）為自變量，以根皮素產率（Y）為響應值進行響應面試驗。響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 模型建立及響應面分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行處理，方差分析見表3。

由表3回歸模型的方差分析結果可知，模型的F值為14.09（P＜0.01），說明擬合的方程極顯著（模型可靠），但是失擬項的F值為93.15（P＜0.01），說明方程模擬的不好，不能很好用于根皮素產率的分析。因此對該模型進行手動優化，結果見表4。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 手動優化后的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model after manual optimization

由表4可知，手動優化后的回歸模型F值為224.41，說明擬合的方程極顯著（P＜0.01）；同時，失擬項的F值為6.95，失擬項不顯著（P＞0.05），說明用轉化時間、轉化溫度、液料比這3個參數擬合的根皮素產率方程是可行的；此外，該回歸模型的相關系數R2為0.998 0，校正系數（與預測復相關系數（以上參數均說明該模型合理，實驗誤差小，可以用于根皮素產率的分析。

一次項X1對根皮素產率的影響有顯著作用（P＜0.05），X2和X3對根皮素產率的影響達極顯著水平（P＜0.01）；二次項、、對根皮素產率的影響有極顯著作用（P＜0.01）；交互項X1X3對根皮素產率有極顯著影響（P＜0.01），而X1X2、X2X3對根皮素產率的作用不顯著（P＞0.05），無統計學差異。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸分析，得到的回歸擬合方程如下：回歸模型中X1、X2、X3前的擬合系數分別為0.61、1.93、1.99，可知各試驗因素對根皮素產率影響的大小順序為X3（液料比）＞X2（轉化溫度）＞X1（轉化時間），其中液料比和轉化溫度是主要影響因素；回歸方程的變異系數（coefficient of variation，CV）為0.88%，說明數據離散程度較小，在正常范圍內；因此，可用該回歸模型對根皮素產率進行預測和分析。由回歸方程預測得到的根皮苷最佳生物轉化工藝為：轉化時間18.09 h、轉化溫度41.20℃、液料比11.52∶1（V/V），根皮素產率為70.97%。

2.3 響應曲面圖分析與驗證試驗

表4數據通過Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸擬合后，所得響應面圖見圖5。

由圖5可知，當液料比一定時，根皮素產率隨時間的延長而增加，在18 h時趨于穩定；而根皮素的產率隨溫度的升高呈先增后減的趨勢，在40℃時根皮素產率最高，此后根皮素產率呈下降趨勢，分析其原因可能是因為溫度升高，轉化液中酶失活所致。當轉化溫度一定時，根皮素產率隨著時間和液料比的增加而增加，但時間過長可能會導致根皮素的水解，進而影響根皮素產率。當時間一定時，隨著液料比增大，根皮素產率呈增加趨勢；液料比達到11∶1（V/V）后，根皮素產率基本保持不變，此時，底物根皮苷最大限度地參與反應。

基于響應面法分析結果和實際工業生產，將理論最佳工藝調整為：轉化時間18 h、轉化溫度41℃、液料比12∶1（V/V）。在此條件下平行驗證3次，最終試驗結果取平均值，得到根皮素產率為70.12%，與理論值70.97%基本相符，說明該回歸模型可靠。

圖5 轉化時間、轉化溫度、液料比交互作用對根皮素產率影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between conversion time,conversion temperature and liquor-material ratio on the yield of phloretin

3 結論

本試驗利用釀酒酵母可產β-葡萄糖苷酶，該酶專一性地作用于根皮苷的β-D-葡萄糖苷鍵，脫糖基為根皮素。在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken中心組合試驗設計，考察轉化時間、轉化溫度、液料比這三個因素對根皮素產率的影響，建立數學模型，得出根皮苷生物轉化最佳工藝條件為：轉化時間18 h、轉化溫度41℃、液料比12∶1（V/V），底物質量濃度8 g/L。在此條件下，根皮素產率為70.12%。

本研究獲得了釀酒酵母生物轉化根皮苷為根皮素的工藝條件，與傳統化學法和酸堿法相比，具有操作簡單、條件溫和、成本低等優點，為后期根皮素工業化的生成奠定了基礎，但還需要進一步中試調試，以滿足工業化生成的實際需求。

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