木瓜蛋白酶用于選擇性去除齲壞組織的實驗研究

(1 南通市口腔醫院，江蘇 南通 226001； 2 南京醫科大學口腔醫學院； 3 南通大學附屬醫院)

齲病是導致牙體硬組織進行性破壞的一種口腔常見病，臨床表現為牙齒齲壞組織的形成[1-3]。第四次全國口腔健康流行病學部分調查結果顯示，我國兒童患齲率呈上升趨勢，12歲兒童恒牙患齲率約為34.5%。雖然居民口腔保健水平在不斷提高，但齲病仍然是影響居民健康的普遍疾病之一[4]。在過去的傳統齲病治療中使用的非選擇性去齲、預防性擴展等觀念已經逐漸被選擇性去齲所替代[5-7]。陳智等[8]根據硬度，將齲壞牙本質分為軟化牙本質(soft dentin)、皮革化牙本質(1eathery dentin)、韌化牙本質(firm dentin)和硬化牙本質(hard dentin)；并詳細介紹了關于齲壞組織去除的新理念：已脫礦但結構完整的牙本質可以再礦化，應予以保留，由于粘接修復技術的使用，故無需過多去除牙齒硬組織；去齲時，窩洞側壁應保留硬化牙本質，髓壁應保留韌化牙本質，近髓處可保留軟化牙本質防止露髓。

目前，去除齲壞組織多采用渦輪機機械去齲和化學機械方法去齲[9-11]。與前者相比，結合齲齒指示劑的使用，化學機械法去齲更精準、微創、無痛。最新研究發現，齲壞牙本質中的膠原纖維斷裂破壞，木瓜蛋白酶可使破壞的膠原纖維水解，進而軟化齲壞組織，使用手工器械即可刮除[12]。因此，本研究對不同濃度的木瓜蛋白酶去齲能力進行了檢測，并通過掃描電鏡觀察了慢速球鉆去齲和木瓜蛋白酶去齲后牙本質表面的不同情況。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

離體牙(江蘇省口腔醫院頜面外科)，木瓜蛋白酶(都萊生物公司)，殼聚糖(美國HARVEY)，齲齒指示劑(美國皓齒公司Sable Seek)，低速切割機(美國標樂公司IsoMet)，標準型磁力攪拌器(北京大龍公司MS-S)，掃描電鏡(美國FEI)。

1.2 實驗方法

1.2.1木瓜蛋白酶凝膠的制備 配制40 g/L殼聚糖凝膠后，在上述凝膠中加入不同量的木瓜蛋白酶后充分攪拌，分別制成10、30、50、100 g/L的木瓜蛋白酶凝膠，4 ℃避光保存。

1.2.2實驗牙的選擇及分組處理 在江蘇省口腔醫院頜面外科門診，收集50例因牙周炎、牙體大面積缺損或阻生而拔除的有牙本質齲壞的前磨牙或磨牙(已獲患者知情同意)，且均為活髓牙。新鮮離體牙清潔干凈牙周組織后放入提前預冷的無菌雙蒸水中，4 ℃保存并盡快用于實驗。將50例牙本質齲離體牙隨機分成40 g/L殼聚糖凝膠組、10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組5組，每組10例。快速渦輪機去除牙釉質齲后，用低速切割機沿著牙本質齲壞部分的中心將每組牙齒縱切為兩半，一半為對照組，使用慢速球鉆去齲；另一半為實驗組，使用不同濃度的木瓜蛋白酶凝膠去齲。

1.2.3慢速球鉆去齲 使用慢速球鉆去除軟化牙本質、皮革化牙本質、韌化牙本質，保留硬化牙本質。

1.2.4木瓜蛋白酶凝膠去齲 將不同濃度的木瓜蛋白酶凝膠分別注入齲洞內，凝膠與齲壞牙本質充分作用30 s，使齲壞牙本質軟化，并使用小刮匙用很小的力量即可輕輕刮除，反復注入凝膠3～4次，直至木瓜蛋白酶凝膠不再使牙本質軟化為止，最后通過所用的力度評估剩余牙本質的硬度。軟化牙本質：在牙科器械加壓時發生變形，使用尖銳的手用挖器用很小的力量即可刮除軟化牙本質。皮革化牙本質：在牙科器械加壓時不變形，無需太大力量即可被去除。韌化牙本質：在手用挖器刮除時有抵抗力，需要一定的力量才能去除。硬化牙本質：在牙科器械探查時需要加壓，僅鋒利器械或牙鉆可以去除。探針加壓劃過牙本質時可以聽到刺耳的刮擦音。

1.2.5掃描電鏡樣本的制作與觀察 對照組和實驗組離體牙經去齲處理后干燥24 h，將標本用導電膠固定于樣品臺上，真空噴金后，進行掃描電鏡觀察、攝片。

2 結 果

2.1 不同濃度木瓜蛋白酶軟化去除牙本質齲后剩余牙本質硬度的比較

使用小刮匙輕輕刮除軟化牙本質后，40 g/L殼聚糖凝膠和10 g/L木瓜蛋白酶凝膠無法使韌化牙本質齲繼續軟化(圖1A、B)；30 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于韌化牙本質后可使其軟化，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質后，牙本質硬度介于韌化牙本質和硬化牙本質之間(圖1C)；50 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于牙本質齲，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質后，余牙本質層為硬化牙本質(圖1D)；100 g/L木瓜蛋白酶凝膠作用于牙本質齲，使用小刮匙輕輕刮除被軟化的牙本質后，剩余牙本質層也為硬化牙本質(圖1E)。各組剩余牙本質使用齲齒指示劑染色后發現，40 g/L殼聚糖凝膠和10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質被齲齒指示劑著色；30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質部分著色；而50 g/L和100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組剩余牙本質不著色。

2.2 掃描電鏡下觀察

掃描電鏡下，慢速球鉆去齲和50 g/L木瓜蛋白酶凝膠化學機械去齲后，慢速球鉆組牙本質表面較平坦(圖2A)，牙本質玷污層較明顯(圖2C)；木瓜蛋白酶凝膠組牙本質表面凹凸不平(圖2B)，牙本質玷污層較少(圖2D)。

3 討 論

長期以來，去除齲壞組織常規采用單純的機械方法，即使用高速或低速渦輪機機械磨除牙體組織，并預備出一定的固位形和抗力形[13-14]。這種方法雖然能夠快速地去除齲壞組織，但磨牙時不能準確區分齲壞與健康的組織，常常過多地磨除健康牙體組織，并且容易對牙髓組織造成損傷[15]。磨牙時還會出現令病人恐懼的疼痛感。而化學機械方法去齲在一定程度上能夠避免單純機械磨除法產生的上述問題[16-18]。化學機械法通過化學材料作用于齲壞組織后，選擇性地軟化齲壞的牙本質，利用比較銳利的手工牙科器械就可將軟化的齲壞牙本質刮除干凈，并且不破壞健康的牙體組織，它是一種精準的、微創的去除齲壞組織方式，代表了口腔醫學精準治療的未來發展的趨勢[19-21]。

本研究結果表明，50 g/L和100 g/L濃度的木瓜蛋白酶可以軟化韌化牙本質，而對硬化牙本質無顯著影響。對于牙本質淺層齲、中層齲，可以使用含有50 g/L的木瓜蛋白酶去除齲壞至硬化牙本質層，有效防止過多的破壞健康牙體組織。而對于近髓的牙本質深齲，應予以保留近髓處的軟化牙本質，通過氫氧化鈣間接蓋髓術使牙本質再礦化，盡可能地保護牙髓組織，避免露髓的發生[22]。研究表明，軟化牙本質冠方的嚴密充填可以有效阻止齲損的進行性發展，這可能與粘結材料嚴密充填冠方的窩洞后，控制了剩余軟化牙本質的生物膜和齲活性有關，使齲損不再進一步發展，軟化牙本質得以再礦化[23]。

A、B、C、D、E分別為40 g/L殼聚糖凝膠組、10 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、30 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組、100 g/L木瓜蛋白酶凝膠組。

圖1不同濃度木瓜蛋白酶去齲后牙本質著色程度

A、B、C、D分別為慢速球鉆組(放大1 000倍)、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組(放大1 000倍)、慢速球鉆組(放大2 000倍)、50 g/L木瓜蛋白酶凝膠組(放大2 000倍)。

圖2恒牙去齲后牙本質表面形態

本研究掃描電鏡結果表明，木瓜蛋白酶去齲后，牙本質表面凹凸不平。粗糙的表面加大了粘結面積，使粘結劑、樹脂與牙面間形成更加牢固的結合，這些情況更有利于窩洞側壁的粘結修復，使充填更加嚴密[24]。本研究還發現，經木瓜蛋白酶處理后的牙本質表面玷污層較少。眾多研究表明，去除玷污層后有利于增加粘結強度。但也有研究認為，隨著粘結技術的發現，玷污層不會對樹脂粘結造成顯著影響[25-27]。

綜上所述，木瓜蛋白酶能夠選擇性地去除齲壞牙本質，對硬化牙本質無顯著影響，能夠最大限度地保存健康牙體組織，可以成為一種精準、微創、安全無痛的去齲方式。

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