多模板液態活檢技術在三陰性乳癌基因突變檢測中的應用

PAUL Dempsey

(1 珠海市婦幼保健院乳腺外科，廣東 珠海 519000； 2 珠海市中心血站；3 珠海麗珠圣美醫療診斷技術有限公司； 4 Cynvenio Biosystems, Inc.)

乳癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬婦女罹患乳癌。隨著診斷技術與新藥研發的發展，目前乳癌的治療進入了分子分型的時代[1]。早在2013年，St.Gallen國際乳癌會議對乳癌分子分型進行了重新定義，將乳癌分為Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體-2(HER-2)陽性和基底樣細胞乳癌。同時，認為基底樣細胞乳癌與三陰性乳癌(TNBC)的發病人群中一致率大約為80%。TNBC指的是雌激素受體、孕激素受體及HER-2均陰性表達的一類乳癌[2-3]，其發病率大約占乳癌病人的15%[4]。

TNBC病人多為年輕、絕經前女性(40歲前為主)。該腫瘤的內部異質性強，常伴有BRCA1突變，目前還沒有發現可針對治療的靶點或者免疫療法。細胞毒性藥物治療是唯一的常用治療手段，但耐藥情況明顯[5]，易發生淋巴結轉移、復發或遠處轉移，預后效果不理想。大部分病人手術后3年內易發生復發或轉移，且在復發后進展迅速[6]。多項研究顯示，TNBC是復發率最高的乳癌亞型，高達1/3的病人會復發，包括首診為癌癥早期的病人[6-8]。然而目前還沒有一種準確高效的方法在復發或者轉移發生前或早期對病人進行有效的監測或評估。近年來，液態活檢技術在臨床上的應用，使對TNBC病人復發或轉移的監測成為可能[9-10]。美國強生公司的CellSearchTM是全球第一個經過FDA和CFDA批準用于惡性腫瘤疾病管理的檢測循環腫瘤細胞(CTC)的商業化產品，其適應證為轉移性乳癌。然而單一的細胞計數功能并不能滿足目前臨床的需求[11-12]。除了CTC技術外，游離DNA(cfDNA)在腫瘤檢測中的應用也進入快速發展的時期。美國Cynvenio公司為全球首家采取高純度提取CTC及cfDNA進行DNA測序的企業，擁有該領域全球最新一代的高純度分離技術，并通過自主開發軟件和工作流程來進行罕見細胞的測序，相關產品包括TargetPrepTM與OncoPrepTM等。本研究旨在探討多模板液態活檢技術在TNBC復發及轉移風險評估中的應用價值，以利于臨床及時采取措施對病人進行干預。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究入組病人211例，年齡28～84歲，年齡中位數53歲。臨床分期：Ⅰ期75例，Ⅱ期95例，Ⅲ期35例，Ⅳ期2例，未能提供信息4例。病人均經病理檢查確診為TNBC。共獲得血標本826份，收集時間為2014年1月—2015年12月，病人的血標本來自美國多家醫院。病人接受檢測的時間間隔不少于3個月，每位病人跟蹤采樣3～5次。

1.2 檢測方法

1.2.1對CTC突變情況的檢測 每次檢測需要采集病人血液8 mL。其檢測步驟包括樣本前處理、血液上機分離腫瘤細胞、CTC測序。CTC捕獲分離平臺為美國Cynvenio公司自主研發，其原理通過使用微流控免疫磁珠篩選及免疫熒光檢測法定量檢測全血中的上皮特征抗原陽性細胞。首先，向樣本中加入生物素標記的捕獲抗體、鏈霉親和素標記的磁珠，其中捕獲抗體為上皮特異性細胞黏附分子(EpCAM)。經過抗原與抗體特異性反應形成磁珠-捕獲抗體-檢測抗體的復合物1；同時向樣本中加入熒光標記的CD45檢測抗體，使其與白細胞表面的CD45抗原結合形成白細胞-CD45檢測抗體復合物2；用核酸染料對細胞核進行染色。將處理后的樣本及底部、頂部緩沖液同時通過鞘流芯片，密度關系為底部緩沖液>樣本>頂部緩沖液，由于密度差異在芯片中形成鞘流，使樣本不直接接觸芯片，避免絕大部分復合物2的非特異性吸附。同時通過磁力將樣本中的復合物1分離到鞘流芯片的上層，實現目標細胞的富集和分離(圖1)。完成富集后，通過熒光顯微鏡掃描鞘流芯片，實現目標細胞的識別以及檢測[13-14]。

1.2.2對cfDNA突變情況的檢測 采用德國Qiagen QiAamp ccfDNA kit提取病人外周血液中的DNA。采集血樣后4 h內進行處理，采用紅細胞裂解液裂解紅細胞，提取cfDNA。所用測序儀器為美國Thermo Fisher Ion Torrent S5XL，采用Thermo Ion Reporter軟件以及Cynvenio TargetCall生物信息分析軟件對測序數據進行分析。ClearIDTM為美國Cynvenio公司針對癌種定制的腫瘤檢測試劑盒，本研究采用的為ClearIDTM定制的“27基因”乳癌檢測試劑盒。

圖1 鞘流示意圖

1.3 結果判定及意義

ClearIDTM支持CTC和cfDNA的檢測，報告閾值為1.0%，以該閾值為突變陽性判斷標準。經過先前的實驗驗證，基因檢測在正常的cfDNA以及以細胞為基礎的質控中顯示假陽性的概率為0.001 0%～0.000 7%。

1.4 統計分析

采用SPSS 21軟件進行統計處理。采用卡方檢驗及McNemer檢驗比較樣本中CTC及cfDNA突變陽性率，采用Kappa檢驗判斷2種檢測方法結果是否具有一致性[15]。

2 結 果

2.1 CTC與cfDNA突變檢出結果

對211例病人標本進行檢測顯示，163例病人在至少一個標本中發現突變，48例病人在標本中未發現任何突變；59例檢出突變的病人在連續2次采集的血標本中發現突變；18例病人在連續2次采集的標本中發現相同的突變；1例病人在連續2次采集的標本中發現CTC及cfDNA均有突變。

211例病人共采集826份血標本，其中，cfDNA標本突變的檢出率為22.84%，CTC標本突變的檢出率為19.84%，同一病人在cfDNA及CTC標本中都檢出突變的概率為4.28%。同時，選取其中進行了cfDNA與CTC兩項檢測的病人共檢測血標本194份，cfDNA和CTC兩種檢測結果差異有顯著性(χ2=3.108，P<0.05)；2種檢測結果的一致性較差(Kappa=0.091)。見表1。在373份檢出突變標本中，TP53、PIK3CA以及EGFR突變的檢出率分別為52%、33%、7%。

表1 194份血標本cfDNA及CTC檢出突變情況 (份)

2.2 腫瘤復發病人的突變情況

截止到2017年5月，共有11例病人出現復發，復發部位10例為乳腺，1例為卵巢。11例病人從治療到復發平均時間為21個月。對該11例發生復發的病人CTC及cfDNA情況進行分析，發現所有復發病人，都在連續的血標本中檢測出腫瘤相關突變。對比11例復發病人的多次檢測結果，在連續的檢測中持續檢出相同突變的概率為36%，而這些相同的突變中，僅有約50%可以在cfDNA與CTC中都被檢出。

3 討 論

本研究結果顯示，大部分(77.25%)TNBC病人被發現在至少一個液體活檢標本(cfDNA或CTC)中檢測出了基因突變類型。其中，TP53、PIK3CA、EGFR為檢出率最高的3種突變類型。TP53的檢出率為52%，與已有研究結果相比較低[16]。TP53是人體重要的抑癌基因，在正常細胞中低表達，在惡性腫瘤中高表達[16]。TP53基因翻譯的P53蛋白是細胞生長、增殖和損傷修復的重要調節因子[8,17-20]。PIK3CA以及EGFR都屬于原癌基因[21-24]。EGFR一直是TNBC領域的研究熱點[25]，三陰性乳癌中，EGFR陽性表達情況與腫瘤的組織學分級有關，與其治療預后也有相關性[4,26-27]。這也為新藥研發帶來了啟示，EGFR有可能會成為TNBC有效的治療靶點[28-29]。

與無腫瘤復發的病人相比，出現腫瘤復發的病人均能在cfDNA或CTC檢測中發現突變。而對比cfDNA與CTC的檢測結果，認為兩種檢測源攜帶不一致的突變信息，同時檢測cfDNA及CTC能夠更完整地反映病人的基因突變情況，可以對病人的復發或轉移風險做更準確的評估。

STOVER等[30]的一項Meta分析研究納入了1 419例接受新輔助化療前的乳癌病人，采用空心針穿刺乳腺組織獲取標本后，綜合分析其基因信息及臨床特征。該研究認為，病人的病理完全緩解率和增殖相關基因發生突變的關系密切。針對TNBC病人，研究者篩選出60個具有預測價值的突變基因，其中有38個基因與細胞增殖相關。該研究也從理論層面表明了，可以通過對病人基因突變情況進行分析，用來作為TNBC病人復發及轉移的評估預測方法。

液態活檢技術在TNBC復發或轉移的監測中有明顯優勢，該研究展示了使用多模板的方法連續監測的應用效果，認為連續監測的結果能夠預測病人的復發及轉移的風險。同時，通過對突變情況進行分析，也更好地理解了TNBC這種具有高度特異性腫瘤的生物學特點[4,23,26]。本項研究仍然需要進一步完善，因為隨著隨訪時間的延長，可能會有更多的病人發現復發。通過對數據進行再次分析，可以得到更多對TNBC診療有指導意義的結果。

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