植酸不同水解率產(chǎn)物對結(jié)直腸癌移植模型腫瘤細(xì)胞分化的影響

(青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021)

目前，結(jié)直腸癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率位居第三位[1]，在全世界癌癥死亡率中居第四位[2]。隨著人們飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。植酸(IP6)是一種天然存在的碳水化合物，存在于高纖維食物(如谷類和豆類)中，其中以豆類植物種子、谷物麩皮和胚芽中含量最高[3-6]。大量的體內(nèi)和體外實驗證明植酸對于多種腫瘤具有抑制作用[7-12]。SAAD等[13]研究顯示，植酸不會對正常細(xì)胞的生長產(chǎn)生不良影響。臨床研究顯示，癌癥患者在化療期間接受植酸干預(yù)之后，能夠很好地改善生活質(zhì)量[14]。惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞分化失常有關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成為治療腫瘤的一種新途徑。國外一些學(xué)者研究顯示，植酸可以通過誘導(dǎo)結(jié)直腸癌分化來抑制腫瘤的惡性發(fā)展[15]。來源于神經(jīng)細(xì)胞瘤的骨髓細(xì)胞瘤病毒相關(guān)癌基因(N-MYC)下游相關(guān)基因1(NDRG1)是從分化的結(jié)直腸癌細(xì)胞中分離出來的一種新的基因，在細(xì)胞分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。NDRG1能夠誘導(dǎo)腫瘤分化[16-17]，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[18-19]。膳食中的植酸進(jìn)入人體后，在腸道菌群酶的作用下，能水解成植酸水解產(chǎn)物，而植酸水解產(chǎn)物也具有抗癌活性，能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長[20]。我們課題組前期研究顯示，100 mg/L的30%和90%植酸水解率產(chǎn)物對CT-26細(xì)胞的增殖抑制效果較植酸明顯。本研究以此為基礎(chǔ)，通過建立結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型，研究植酸及其水解產(chǎn)物對NDRG1蛋白表達(dá)的影響，探討植酸水解產(chǎn)物與植酸產(chǎn)生的效果之間的差異，并進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)腫瘤分化的機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞株CT-26購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將CT-26細(xì)胞置于含有體積分?jǐn)?shù)為0.15的胎牛血清以及青鏈霉素(青霉素的濃度為100 kU/L，鏈霉素濃度為0.1 g/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 動物及飼養(yǎng)

雄性BALB/c小鼠28只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)。在SPF條件下，在平均溫度(24±2)℃，平均濕度(52±8)%環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，食用飼料，自由飲水。

1.3 試劑

植酸鈉購于北京華邁科公司(純度≥98%)；30%和90%植酸水解率產(chǎn)物為實驗室制備。Wes-tern blot相關(guān)試劑購買于碧云天生物技術(shù)公司。NDRG1抗體購于英國Abcam公司，N-MYC抗體、同源磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)抗體、β-actin抗體購于美國Proteintech Group生物技術(shù)有限公司。

1.4 小鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型制備及分組

將含有5×109個/L細(xì)胞的CT-26細(xì)胞懸液注射到小鼠右側(cè)背部皮下，每只注射0.1 mL。待生長至2周且腫瘤體積達(dá)到1 cm×1 cm大小時造模成功，將造模成功的28只小鼠按照腫瘤結(jié)節(jié)大小進(jìn)行隨機區(qū)組分組，分為生理鹽水組(A組)、30%植酸水解率產(chǎn)物組(B組)、90%植酸水解率產(chǎn)物組(C組)及植酸組(D組)4組，每組7只小鼠。分組后第2天，小鼠分別給予生理鹽水及濃度為100 mg/L的30%植酸水解率產(chǎn)物、90%植酸水解率產(chǎn)物和植酸，進(jìn)行瘤體四周多點注射，每次注射0.1 mL，每周2次，連續(xù)注射10周。

1.5 腫瘤體積計算及病理學(xué)觀察

在藥物干預(yù)期間，每周測量并記錄瘤塊大小。于末次注射藥物后12 h(禁食禁水)，處死小鼠。摘除小鼠背部的腫瘤，測量腫瘤體積。用多聚甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察。計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(對照組平均腫瘤體積-實驗組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%

1.6 Western blot方法檢測腫瘤組織內(nèi)N-MYC、NDRG1、PTEN蛋白表達(dá)情況

取約50～100 mg腫瘤組織，用無菌手術(shù)剪將組織剪成細(xì)小的碎片，然后加入含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，提取腫瘤組織的總蛋白。用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液，混勻，然后加熱，使蛋白變性。蛋白冷卻后加入到SDS-PAGE凝膠上電泳分離，將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后重新加入二抗孵育2 h。加入ECL發(fā)光液放入FusionFX5顯影儀中顯影，得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況

小鼠接種CT-26細(xì)胞后，C組和D組的小鼠精神狀態(tài)良好，行動均自如。A、B、C、D組分別有6、7、7、7只小鼠存活至實驗結(jié)束。A組1只小鼠死于藥物干預(yù)期間，可能是與腫瘤體積較大，腫瘤處發(fā)生潰爛而引起的。B、C、D組小鼠的腫瘤抑制率分別為26.8%、56.73%、43.21%，C組小鼠的抑制率高于D組。

2.2 各組小鼠腫瘤抑制情況

A、B、C、D組小鼠的腫瘤體積分別為(10.71±1.34)、(8.24±0.46)、(4.75±0.80)、(6.67±1.96)cm3，A組的小鼠腫瘤體積較大，個別腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)糜爛壞死結(jié)構(gòu)；B組小鼠腫瘤體積與A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與A組相比，C組及D組腫瘤組織體積相對較小且未出現(xiàn)糜爛壞死結(jié)構(gòu)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.13，P<0.05)；C組小鼠腫瘤體積明顯小于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理檢查結(jié)果

A組與B組小鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞緊密，排列混亂，細(xì)胞核深染，核質(zhì)比增大。D、C組小鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞排列相對整齊，核染色較淺(圖1)。

1、2、3、4分別為A、B、C、D組，HE染色，200倍。

圖1各組小鼠腫瘤組織免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

2.4 各組小鼠移植瘤組織中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表達(dá)

與A組相比，C組和D組N-MYC蛋白的表達(dá)水平降低(F=30.65，P<0.05)，NDRG1和PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.73、14.69，P<0.05)；C組的效果優(yōu)于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2各組小鼠移植瘤組織中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表達(dá)情況

組別N?MYCNDRG1PTENA組1．38±0．220．50±0．090．53±0．11B組1．24±0．110．59±0．110．80±0．10C組0．46±0．051．53±0．301．30±0．22D組0．74±0．110．91±0．110．85±0．12

3 討 論

植酸的水解產(chǎn)物由多種次級磷酸化形式組成，包括五磷酸肌醇、四磷酸肌醇、三磷酸肌醇、二磷酸肌醇、一磷酸肌醇以及肌醇，付余英[21]研究顯示，當(dāng)植酸水解率達(dá)到83%和100%時，植酸水解產(chǎn)物主要為一磷酸肌醇和肌醇。肌醇也可以發(fā)揮溫和的抗腫瘤作用。國外研究顯示，肌醇能夠有效地降低乳腺癌細(xì)胞分化和傳播速度[22-23]。國內(nèi)研究顯示，植酸和肌醇聯(lián)用能夠?qū)Y(jié)直腸癌發(fā)揮更好的抑制作用[24-25]，因此我們認(rèn)為90%水解率時的主要產(chǎn)物是肌醇，它可以與植酸聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤作用，抑制結(jié)直腸癌生長。我們課題組的前期研究顯示，100 mg/L的90%水解率產(chǎn)物對CT-26細(xì)胞的抑制效果相對植酸較明顯[20]。前期關(guān)于植酸水解產(chǎn)物的研究主要集中在工業(yè)方面，而將其用于動物實驗的研究卻較少[26-27]。本研究以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行動物實驗，建立BALB/c小鼠結(jié)直腸癌移植瘤模型，顯示C組和D組小鼠腫瘤體積相比A組明顯減小，這表明90%水解率產(chǎn)物和植酸均能抑制腫瘤的生長，并且90%水解率產(chǎn)物的效果優(yōu)于植酸，這與我們前期的研究結(jié)果相一致。

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞分化失調(diào)有關(guān)，細(xì)胞分化的調(diào)控，受到多因素多方面的影響。在對植酸及其水解產(chǎn)物誘導(dǎo)結(jié)直腸癌分化機制的研究中，本研究觀測了植酸及其水解產(chǎn)物對分化相關(guān)因子NDRG1、N-MYC以及PTEN表達(dá)的調(diào)控。結(jié)果顯示，A組中小鼠NDRG1蛋白表達(dá)水平較低，C組和D組的NDRG1蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，這表明植酸及其水解產(chǎn)物可以通過上調(diào)NDRG1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞分化，抑制腫瘤的生長及發(fā)展。NDRG1基因的表達(dá)會受到較多種因素的影響。NDRG1是N-MYC的下游基因，受到N-MYC的調(diào)控[28-29]，本研究結(jié)果顯示，A組小鼠N-MYC蛋白的表達(dá)水平明顯上升，且NDRG1蛋白水平呈低表達(dá)，腫瘤體積增長速度較快。這表明90%水解率產(chǎn)物可以抑制N-MYC蛋白的積累，從而促進(jìn)其下游NDRG1的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型，抑制腫瘤發(fā)展。國外一些學(xué)者證實，PTEN和NDRG1的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性[30-31]。本研究結(jié)果顯示，植酸及其水解產(chǎn)物組的PTEN蛋白表達(dá)水平高于對照組，這表明植酸及其水解產(chǎn)物上調(diào)了PTEN的表達(dá)，增強了NDRG1的表達(dá)水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制腫瘤生長。

綜上所述，本研究建立了結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型，顯示30%和90%植酸水解產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌分化，通過對分化相關(guān)因子NDRG1、N-MYC以及PTEN的進(jìn)一步研究顯示，植酸及其水解產(chǎn)物能夠提高NDRG1和PTEN蛋白的表達(dá)水平，降低N-MYC蛋白的表達(dá)水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，且90%植酸水解產(chǎn)物抑制腫瘤的效果優(yōu)于植酸。植酸不同水解率產(chǎn)物抗腫瘤作用及其機制的進(jìn)一步研究，對于癌癥的防治具有重要意義，但其誘導(dǎo)結(jié)腸癌分化的具體作用機制有待進(jìn)一步的觀察。

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