慢病毒介導的RNA干擾沉默RRS1基因對乳腺癌細胞MCF-7生物學行為的影響

(青島大學醫學院生物化學與分子生物學系，山東 青島 266021)

乳腺癌發病率逐年提高[1]，并呈年輕化發展的趨勢[2]，占女性惡性腫瘤發病率的第一位，其死亡率居惡性腫瘤死亡率的第二位[3]。其治療手段主要包括手術治療、放化療及內分泌治療等。但是，乳腺癌病因多種多樣，如膳食方面，高碳水化合物、高脂肪、高蛋白飲食是乳腺癌發病的高危因素，蔬菜水果等富含膳食纖維和維生素的食物是乳腺癌很好的保護因素[4-10]；適當的運動也會降低乳腺癌的發病風險。近年來，乳腺癌內科治療中的基因靶向治療成為臨床研究的熱點[11]。但乳腺癌相關生物標志物和藥物治療靶點研究尚不足，需要進一步對相關因子進行探討。本研究根據乳腺癌成對樣本信息，通過高通量差異表達基因篩選和生物信息分析，成功篩選出一個新的對乳腺癌有重要作用的基因——核糖體合成調控因子RRS1(Regulator of Ribosome Synthesis 1)基因。為了解分析RRS1在乳腺癌中的作用，本實驗采用慢病毒介導的RNA干擾MCF-7細胞中RRS1基因的表達，探討此基因對MCF-7細胞增殖、凋亡、遷移及周期的影響，為進一步探討其作用機制與臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HMEC細胞(上海吉尼歐公司)，MCF-7細胞(青島大學附屬醫院中心實驗室)，胰蛋白酶-EDTA(0.53 mmol/L)消化液、RIPA蛋白提取試劑盒、DMSO、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、MTT及PI試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，RNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術有限公司)，慢病毒轉染載體和轉染試劑盒(上海吉凱基因公司)，RRS1、β-Actin引物(上海生工生物工程有限公司)，小鼠抗人RRS1單克隆抗體以及小鼠抗人β-Actin單克隆抗體(美國Abcom公司)，Annexin V-APC凋亡試劑盒(Ebioscience美國公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM/HIGH培養基(美國Hyclone公司)，Trizol RNA提取試劑盒、DAPI試劑(美國Invitrogen公司)，Transwell遷移小室(美國康寧公司)，Caspases-Glo 3/7 Assay試劑(美國Promege公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 細胞用含體積分數0.10胎牛血清的DMEM高糖培養基，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度培養箱中培養，細胞培養至指數分裂時進行實驗。取對數生長期的細胞用胰酶消化，計數后每孔將2.5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達到30%時，分別進行轉染。

1.2.2Western blot方法檢測RRS1在MCF-7與正常乳腺上皮細胞HMEC中的表達 分別培養乳腺癌MCF-7細胞與正常乳腺上皮HMEC細胞，當細胞融合度達90%時，棄掉培養基，分別用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取總蛋白；BCA法測定并調整蛋白的濃度，加入5×Loading buffer后煮沸5 min使蛋白高溫變性(變性后可-20 ℃儲存)。然后選用120 g/L的SDS-PAGE不連續凝膠系統進行電泳分離，經電轉裝置將蛋白轉移至PVDF膜上。用含50 g/L BSA的TBST封閉液緩慢搖床封閉2 h，然后分別用1∶1 000稀釋的鼠抗人RRS1一抗4 ℃孵育過夜，以β-actin作為內參蛋白；TBST洗膜3次，每次10 min；用對應二抗室溫孵育2 h；重復TBST洗膜步驟；ECL液按說明書配比并進行顯影。

1.2.3siRNA序列設計 針對GenBank中RRS1基因的序列(NM_015169)，根據RNAi序列設計原則，設計出針對目的基因序列的多個RNAi靶點序列，通過軟件評估預測，篩選出最佳干擾靶點序列為GCTGCCTTCATTGAGTTTA。兩端添加合適的限制性內切酶酶切位點以完成載體構建，并在正義鏈3′端添加TTTTT終止信號，反義鏈5′端添加終止信號互補序列，因此正義鏈為5′-CCGGCCGCTG-CCTTCATTGAGTTTACTCGAG(loop)TAAAC-TCAATGAAGGCAGCGGTTTTTG-3′;反義鏈為5′-AATTCAAAAACCGCTGCCTTCATTGAGTTT-ACTCGAG(loop)TAAACTCAATGAAGGCAGC-GG-3′。為了排除載體造成的影響，設置以亂序為核心序列的陰性對照，設計原則同上。將兩組RNA分別感染MCF-7細胞，即得到shRRS1實驗組和shCtrl陰性對照組MCF-7細胞。

1.2.4慢病毒轉染 根據慢病毒轉染操作手冊預實驗，得出對于實驗組和對照組細胞的MOI值均為20，最適作用時間為9 h。而后換成添加含體積分數0.10胎牛血清的培養基繼續培養，轉染48 h后熒光觀察GFP表達率，即代表病毒轉染率，選取達到90%以上穩定轉染的細胞進行后續實驗。

1.2.5熒光定量PCR(qPCR)檢測細胞mRNA表達水平 將穩定轉染的兩組細胞用Trizol法分別提取總RNA，測定各組RNA濃度與純度，反轉錄合成cDNA，然后進行qPCR。反轉錄條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃暫時保存。合成cDNA后，根據qPCR試劑盒使用說明配制反應體系，為提高特異性，減少引物二聚體和錯配等擴增，選用兩步法擴增程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，退火時采集熒光信號，進行40個循環。RRS1基因的上游引物5′-CCCTACCGGACACCA-GAGTAA-3′，下游引物5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′。內參基因GAPDH的上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。每個樣品設3個復孔，比較兩組細胞的相對表達豐度。實驗至少重復3次。

1.2.6Western blot方法檢測細胞RRS1蛋白的表達水平 將穩定轉染后的兩組細胞棄掉培養基，分別用PBS洗1次，RIPA裂解法提取總蛋白，方法同1.2.2。

1.2.7MTT法檢測細胞的增殖能力 取轉染后的兩組細胞，消化后接種于96孔板，每組設5個復孔，每孔約4 000個細胞，共鋪6個板，每天任取一板采用MTT法測細胞的活力。每個板在培養結束前4 h，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT試劑，4 h后棄去培養基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩5 min使甲瓚顆粒完全溶解，然后用酶標儀檢測波長490 nm處各孔的吸光度值，分別制作兩組細胞的生長曲線。

1.2.8細胞周期檢測 收集細胞上清液，并將沖洗用的PBS以及消化后的細胞與之合并，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入1.5 mL預冷的PBS洗1次。然后加入4 mL預冷的體積分數0.70的乙醇溶液(PBS配制)，輕輕吹打成單細胞懸液，4 ℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min。沉淀用PBS洗1次，后1 000 r/min離心5 min。用200 μL PBS和2 μL濃度為20 mg/L的RNase重懸細胞，以37 ℃孵育30 min后，加入500 μL濃度為50 mg/L的PI染液，室溫避光孵育30 min。另取一組空管加入PBS 200 μL，將上述細胞懸液用300目尼龍網過濾至此管混勻，采用流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期。

1.2.9DAPI法檢測細胞的凋亡情況 將穩定轉染后的待檢測細胞棄去培養基，用PBS洗1次，加入適量甲醇固定5 min。棄去固定液后用PBS洗1次，加入少量4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，室溫放置5 min，吸除染色液，用PBS洗滌3次，每次3 min。熒光觀察并拍照。

1.2.10Annexin V-APC單染法檢測細胞的凋亡情況 分別接種穩定轉染后的兩組細胞于6孔板，每組設3個復孔，待細胞融合度達90%時進行凋亡實驗。以不加染料的細胞作為空白對照。先收集細胞上清液，胰酶消化細胞后與上清液合并，1 300 r/min離心5 min，棄上清液，以4 ℃預冷的PBS洗滌細胞沉淀。再用1×binding buffer洗滌細胞沉淀1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入200 μL1×binding buffer重懸細胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC染色，室溫條件下避光15 min后，加入400 μL 1×binding buffer混勻，立即上機檢測(一般不超過1 h)。

1.2.11caspase 3/7實驗檢測細胞凋亡情況 在化學發光專用96孔板中，分別接種兩種穩定轉染細胞，每孔1×104個細胞，細胞懸液體積為100 μL；同時設置一組不含細胞的空白對照，每孔只加入100 μL完全培養基；每組設3個復孔。然后每孔加入100 μL caspase-Glo反應液，將96孔板置于搖板機上以300～500 r/min的轉速輕搖30 min混勻。然后根據細胞狀況18～22 ℃室溫孵育0.5～3.0 h(以1～2 h為宜)。采用酶標儀檢測化學發光信號強度。

1.2.12Transwell實驗檢測細胞轉移情況 取6只Transwell小室置于24孔板中，為了平衡小室，上室在實驗前加入100 μL無血清培養基，37 ℃培養箱中放置1 h。胰酶消化穩定轉染細胞，計數并調整細胞濃度為1×109個/L，小心除去上室中的培養基，加入100 μL細胞懸液，下室中加入600 μL 含300 g/L FBS的培養基，觀察培養26 h后，倒扣小室于吸水紙上以去除培養基，用棉拭子輕輕拭去小室內非轉移細胞。甲醇固定15 min，放入結晶紫染色液中染色15 min。用蒸餾水沖洗掉多余的染液，晾干。顯微鏡下隨機選取9個視野，計算每個視野穿過的細胞數，計算平均值。進行數據分析，比較實驗組與對照組細胞轉移能力的差異。

2 結 果

2.1 乳腺癌細胞MCF-7與乳腺正常細胞HMEC中RRS1蛋白的表達

MCF-7、HMEC中RRS1的蛋白表達水平分別為0.990±0.017、0.304±0.012，兩組比較，差異有顯著性(t=57.485，P<0.05)。見圖1。

圖1 MCF-7與HMEC中RRS1蛋白的表達

2.2 敲減后RRS1基因轉錄與翻譯水平檢測結果

對照組、實驗組RRS1 mRNA表達水平分別為1.083±0.493、0.075±0.065，與對照組相比較，實驗組RRS1 mRNA表達水平明顯降低(t=3.513，P<0.05)。對照組、實驗組RRS1蛋白的表達水分別為1.000±0.079、0.276±0.021，與對照組相比，實驗組RRS1蛋白的表達水平明顯降低(t=8.890，P<0.05)。見圖2。

2.3 細胞增殖能力檢測結果

MTT法檢測細胞活力結果顯示，實驗組細胞增殖能力明顯低于對照組，且隨時間的延長差異性越加顯著(t=11.353～36.289，P<0.05)。見表1、圖3。

圖2 MCF-7細胞中RRS1基因敲降前后蛋白表達水平的變化

a為對照組；b為實驗組。

2.4 細胞周期檢測結果

實驗組、對照組G1期細胞構成比分別為(68.26±1.58)%、(58.56±3.82)%，兩組比較差異具有統計學意義(t=-4.063，P<0.05，n=3)；兩組細胞G2、S期細胞構成比比較，差異無統計學意義。見圖4。

2.5 熒光染色檢測細胞凋亡結果

熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況顯示，實驗組中染色質固縮，出現顆粒物質以及核解體的現象增多，其相對凋亡率為2.207±0.045，對照組為1.000±0.110，兩組相比較，差異具有顯著性(t=-10.138，P<0.05)。見圖5。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況顯示，實驗組細胞凋亡率為(37.13±0.677)%，對照組為(19.57±1.33)%，兩組比較，差異具有顯著性(t=-11.714，P<0.05)。見圖6。

2.7 caspase 3/7實驗檢測細胞凋亡結果

通過對凋亡信號caspase 3/7的檢測，以空白孔為對照，對照組、實驗組的相對發光量分別為20 119.67±417.56、38 361.67±1 648.42，實驗組caspase 3/7活性相對于對照組明顯增加，差異具有顯著意義(t=-18.581，P<0.05)。見圖7。

a為對照組；b為實驗組。

2.8 細胞遷移能力的變化

兩組細胞置于Transwell體系26 h后觀察結果并拍照。實驗組細胞轉移比例為0.433±0.069，對照組為1.000±0.084，兩組相比較，差異有顯著性(t=13.722，P<0.05)。

3 討 論

表1 兩組細胞增殖活力比較

a為對照組；b為實驗組。

腫瘤的發生發展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活，以及凋亡相關分子的狀態有關，表現出細胞持續增殖，凋亡明顯減少，惡性腫瘤細胞還伴有高度遷移能力。乳腺癌作為目前全球女性發病率最高，死亡率居第二位的惡性腫瘤，受到全社會廣泛關注，乳腺癌治療不足嚴重威脅著女性的身心健康。

由于蛋白質是生命的主要承擔者，因此腫瘤細胞中蛋白質的供應至關重要。核糖體是蛋白質的主要制造車間，核糖體的完整性與功能性對生命體至關重要。RRS1是在釀酒酵母中發現的一種核糖體合成調控因子，其參與核糖體5S RNP的裝配、60S大亞基的成熟以及細胞內的運輸過程[12-16]。另外，GAMBE等[17]的研究證明，人宮頸癌HeLa細胞中RRS1在細胞分裂間期定位于核仁，分裂過程中則分散于染色質周圍，RRS1敲減的HeLa細胞表現出染色體排列和紡錘體組裝異常，導致有絲分裂延遲，即RRS1可能參與細胞有絲分裂過程的染色體行為變化。RRS1還與端粒聚集與沉默以及著絲粒的功能有關[17-19]。然而RRS1與人類疾病關系的研究較少，RRS1突變或缺失會引起相應細胞器的功能異常，如參與亨廷頓病的內質網應激反應[20]，以及線粒體疾病的發生[21]。RRS1與腫瘤關系的研究更少，特別是與乳腺癌發病關系的研究尚未檢索到相關文獻報道。

a為對照組；b為實驗組。

本研究通過對乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織進行成對樣本信息高通量篩選檢測，發現RRS1在乳腺癌組織中高表達，這提示RRS1與乳腺癌的關系密切。為了鑒定RRS1對調控乳腺癌發生發展的作用，本實驗采用了慢病毒載體介導的shRNA干擾乳腺癌MCF-7細胞中RRS1的表達，然后檢測MCF-7細胞的增殖、凋亡與遷移能力等改變，進而確定RRS1與乳腺癌的關系。實驗結果顯示，敲減RRS1后出現G1期細胞阻滯、細胞增殖活力隨時間延長而顯著降低的情況；同時，分別從細胞凋亡形態學、細胞膜上凋亡指示分子以及凋亡信號通路中的關鍵分子著手研究，均證明敲降RRS1會使MCF-7細胞凋亡顯著增加；并且，Transwell實驗證實敲降RRS1表達后，MCF-7細胞的遷移能力也顯著降低。最近有關于RRS1與肝癌細胞生長關系的研究結果與本課題結論一致，敲降RRS1表達會抑制SMMC-7721細胞的增殖，凋亡率增加等[22]，進一步證明了RRS1對于腫瘤的促進作用。

a為對照組；b為實驗組。

綜上所述，RRS1可能在腫瘤中起到原癌基因的作用，可能成為乳腺癌治療研究中新的分子靶點。接下來我們將探究RRS1對乳腺癌的作用機制，使RRS1能早日更好地應用于乳腺癌臨床治療。

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