扣囊復膜酵母在釀酒中的應用研究進展

蘇暢，馬瑩瑩，楊建剛

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

扣囊復膜酵母在釀酒中的應用研究進展

蘇暢，馬瑩瑩，楊建剛*

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

扣囊復膜酵母屬于酵母菌的一種，又稱扣囊復膜孢酵母，扣囊擬內孢霉。大量研究發現扣囊復膜酵母廣泛存在于各種酒曲中，能產淀粉酶，酸性蛋白酶，β-葡萄糖苷酶，且其所產的酶都具有較高的活性；除此之外，不少研究發現扣囊復膜酵母還具有一定的產香產酯以及可利用丟糟生產單細胞蛋白飼料的能力。在釀酒工業中，這些酶活性決定了扣囊復膜酵母能夠以各種原料為底物，進行發酵產酒精；其產香產酯能力又在不同程度條件下增加酒的香氣，豐富了酒的風味，又可利用丟糟生產蛋白飼料能力，開辟了白酒酒糟的處理及利用途徑。這些決定了扣囊復膜酵母在釀酒工業中有極大的研究價值和發展潛力，因而備受關注。綜述扣囊復膜酵母的生理生化特性，菌種的選育，產酶、產香產酯特性，以及在處理丟糟方面的一些應用，以期為扣囊復膜酵母在釀酒工業上的合理利用，提供新的思路和方法。

扣囊復膜酵母；菌種選育；酶特性；產香功能；酒糟蛋白飼料

扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），又稱扣囊復膜孢酵母，扣囊擬內孢霉（Endomycopsis fibuligera），是子囊菌屬的一個種，具有完全世代，可形成酵母菌樣出芽細胞及菌絲狀細胞。通過多極出芽和菌絲體形成來增殖，其子囊是球狀的，游離于體細胞或附著于菌絲尾部或壁上。每個子囊能形成兩個到四個帽狀子囊孢子，成熟時釋放[1]。Wikerham等第一次報道扣囊復膜酵母能夠水解淀粉[2]，瑞典Symba酵母工藝（Swedish Symba yeast process）使用的主要酵母就是這種酵母菌。由于扣囊復膜酵母可以分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、和β-葡萄糖苷酶，故它能利用葡萄糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖和可溶性淀粉，它同時也可以和釀酒酵母及運動單胞發酵菌屬混合起來利用木薯淀粉生產酒精[3]，在一些研究報告中，扣囊復膜酵母除了具有較強的糖化能力和產蛋白酶能力，它還具有一定的產酯能力[4]，因而它在釀酒工業中具有重要地位，也是近年來發酵行業研究的熱點。

1 扣囊復膜酵母在酒曲中分離研究進展

酒曲是谷物及其輔料經蒸煮后接種或自然接種定型發酵而成、用于白酒釀造的糖化發酵劑。酒曲中含有多種微生物及其產生的復雜酶系，在中國白酒釀造中起著糖化、發酵、生香的作用[5]。扣囊復膜酵母廣泛存在于各種酒曲，但目前國內釀酒行業對其研究較少，對扣囊復膜酵母的研究主要集中在黃酒、米酒等釀造酒領域及清香型白酒中，在這些研究中扣囊復膜酵母在酒曲中的真菌菌群中多以優勢菌的形式展現，在濃香型白酒酒曲和醬香酒曲中也常常能分離得到一定量的扣囊復膜酵母[6-10]。

胡佳音等采用傳統分離方法結合高通量測序對清香、醬香、濃香3種大曲真菌進行多樣性分析，兩種方法所獲得結果較為一致。研究表明，清香型大曲真菌主體較為明顯，扣囊復膜酵母和傘枝橫梗霉是絕對主體，占94%，其中所分離的扣囊復膜酵母數量為340×104cfu/g，而生香酵母和釀酒酵母數量較少。而濃香型大曲中所分離的扣囊復膜酵母，數量為6×102cfu/g，相對清香型大曲所分離的扣囊復膜酵母來說，數量較少。濃香型大曲和醬香型大曲多樣性結果較為接近，兩種大曲中較難分離到酵母類真菌，其主體菌均為謝瓦散囊菌；區別在于，濃香型大曲中真菌種類較多，數量較為接近，而醬香型大曲中，真菌多為耐熱絲狀真菌和青霉菌[11]。在以汾酒為代表的清香型白酒研究中，馬凱、崔哲男等從汾酒大曲曲房曲堆中隨機取上、中、下取3份大曲樣品。分離出81株真菌，并對這81株菌進行了基于ITS基因序列的分子生物學鑒定。結果表明，在汾酒大曲中分布有6個屬的霉菌和4個屬的酵母菌，其中扣囊腹膜孢酵母是優勢酵母菌種，傘枝犁頭霉和匍枝根霉是優勢霉菌菌種[12]。推斷清香型大曲中扣囊覆膜酵母在清香型大曲酒發酵過程有著重要的作用。糯米酒是中國特色的傳統釀造酒，在其釀造過程中酒曲起關鍵作用。傳統酒曲的微生物數量及種類難以控制，造成酒曲質量不穩定。應玲云等，將該酒曲稀釋涂布在淀粉培養基（YPS）平板上培養，得到1株產淀粉酶酵母菌。通過形態學、生理生化特征和ITS區序列分析鑒定為扣囊復膜酵母，隨后應玲云等將該扣囊復膜酵母在YPS液體培養基中28℃培養4 d，用Yoo改良法測得其粗酶液的淀粉酶活力為49.8 U/mL。隨后運用該酵母菌進行產酒精實驗，使其在糯米糖化液（含175 g/L葡萄糖）中28℃發酵3 d，測得酒精度為5.63%（v/v）。發現該扣囊復膜酵母既能同化淀粉又能發酵產生酒精，具有用于純菌種釀造糯米酒的潛力[13]。我國有五千多年的黃酒釀造歷史，已經形成諸多風格獨特的黃酒品牌，但是能夠代表中國黃酒總體特色的只有紹興黃酒[14]。酒藥或稱小曲、白藥、酒餅，是以秈米粉、辣蓼草等為主要原料制作而成，兼具有糖化和發酵的雙邊作用，是我國獨特的釀酒用糖化發酵劑[15]。比較有代表性的酒藥，包括紹興酒藥、寧波酒藥、蘇州甜酒藥、上海崇明“八二曲”、常州曲藥等[16]。在我國南方地區，以酒藥做糖化發酵劑來釀制黃酒和小曲白酒十分普遍，酒藥內也蘊含著豐富的釀酒微生物資源[17]。臧威，謝廣發等從紹興地區5個主要黃酒生產企業，采集古越龍山、會稽山、塔牌、沈永和、女兒紅及鑒湖6個品牌酒藥樣本，在數量、種類和分布規律等方面對黃酒酒藥內酵母菌物種資源進行了系統研究，遵循酵母菌分類原則，從紹興黃酒酒藥中分離鑒定出3種酵母菌，扣囊復膜孢酵母、釀酒酵母和隱球酵母。其中，扣囊復膜孢酵母在6個品牌黃酒酒藥內的分布占有絕對優勢，該種酵母菌可能對紹興黃酒酒藥的生產性能來說至關重要。并且推測出扣囊復膜孢酵母在紹興黃酒釀造過程中的重要性并不在于轉化糖類物質形成酒精的能力，而是參與糯米等釀酒原料中淀粉等大分子物質糖化水解過程并發揮重要作用[18]。

2 扣囊復膜酵母產酶特性

2.1 扣囊復膜酵母產β糖苷酶特性

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21），其英文名為 β-glucosidase，亦稱纖維二糖酶，其能水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖。在纖維素酶水解纖維素的過程中，β-葡萄糖苷酶可以水解纖維二糖從而釋放出葡萄糖成為關鍵的一步。在纖維素降解、食品風味的改善等領域具有重要的應用價值。在釀酒工業中，大曲原料中大麥和豌豆含有大量的纖維素，酵母對其利用率不高，而扣囊復膜孢酵母與釀酒酵母的協同作用，能夠提高纖維素的利用率，提高酒精的產量[19]。

張梁、周衍等用潮霉素B選擇性標記的pRS41H質粒為載體。在工業釀酒酵母自身的gpd2啟動子、終止子下，使扣囊復膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶（BGL基因）在工業釀酒酵母中進行表達。在潮霉素B500μg/mL的培養基上挑選、得到重組子S．cerevisiae BGL，可以在以纖維二糖為唯一碳源的培養基上生長，并且36 h時。測得最高酶活為8.18 U/mL。在纖維二糖為唯一碳源的酒精發酵中，發酵12 h時酒精度達到0.015%[20]。Makoto Machida，Isao Ohtsuki等從扣囊復膜酵母中分離出兩種β-葡萄糖苷酶，即BGL1和BGL2兩個基因，分別將BGL1和BGL2導入釀酒酵母中在以纖維二糖為底物的條件下進行發酵，發現含有BGL1基因的釀酒酵母能夠有效水解纖維二糖且能發酵生成乙醇，而含有BGL2基因的釀酒酵母卻不能[21]。紅薯渣是紅薯加工過程的殘渣，干物質中蛋白含量低，纖維含量高。如果能將紅薯渣進行有效利用，將其用來產蛋白，將是一舉兩得的事情。安文亭、劉樹棟等以紅薯渣為原料，以酵母茵、霉菌、植物乳桿菌、酸菌芽孢桿菌作為發酵菌種，研究不同菌種混菌組合發酵紅薯渣對薯渣營養價值的影響。結果表明，發酵紅薯渣的適宜三菌、四菌組合分別為枯草芽孢桿菌+扣囊酵母+黑曲霉和枯草芽孢桿菌+扣囊復膜酵母+綠霉菌+植物乳桿菌。三菌發酵中枯草芽孢桿菌+扣囊復膜酵母+黑曲霉所得到發酵產物真蛋白總量提高了33.17%，粗纖維總量降低了21.03%。四菌發酵中枯草芽孢桿菌+扣囊復膜酵母+植物乳桿菌+綠霉菌發酵產物真蛋白總量提高了44.30%，粗纖維總量降低了26.60%[22]。

以上研究表明，扣囊復膜酵母產β-葡萄糖苷酶具有高酶活，能夠將其運用在釀酒行業，能將高分子纖維二糖水解成可用來的發酵的葡萄糖，釀酒原料得以充分利用，避免了原料的浪費。此外，有研究表明β-葡萄糖苷酶能將葡萄中的非揮發性糖苷轉化成揮發性的香氣物質，提高葡萄酒香氣復雜性，改善葡萄酒質量[23-24]。所以，如果能將扣囊復膜酵母產高酶活的β-葡萄糖苷酶這一特性，將其運用到葡萄酒釀造行業，能夠起到豐富葡萄酒香味成分的作用。

2.2 扣囊復膜酵母產淀粉酶的特性

淀粉酶是指能將淀粉水解成各種低分子糖的酶的總稱，是一種應用極廣的酶類。扣囊復膜酵母具有很強的產淀粉酶的能力，可以高效的利用淀粉質原料，是酒曲微生物的重要組成部分，眾多科技工作者都對此進行了廣泛而深入的研究。所以選育出產淀粉酶的高酶活的菌株，進行發酵產酒條件優化或構建能直接利用淀粉的釀酒酵母工程菌都具有特殊的重要意義。

自然選育出的高淀粉酶活酵母菌株與工業菌株比較，具有專一性釀造的優勢。陳蕾對實驗室已篩選的一株高淀粉酶活扣囊復膜酵母進行發酵條件優化，并且通過表面相應法對固體發酵條件進行優化設計，得到最終優化條件為濕度61.5%（v/v），底物配比（稻殼：麥麩）0.42，淀粉2.0%（w/w），接種量為 2.0%，28℃培養，天然pH；在最優條件下，該扣囊復膜酵母在固體發酵淀粉酶的酶活力在120 h內達到了4 296 U/g，在此基礎上，利用該菌株與一株釀酒酵母進行發酵，發酵結束后測得酒精度達到了10.5%（v/v）[25]。庾昌文，薛棟升等從清香型小曲酒醅中分離得到高產淀粉酶酵母，由形態及5.8S-ITS rDNA片段序列分析鑒定為復膜孢酵母屬扣囊復膜孢酵母。發現該菌在基礎發酵培養基中，菌株生長與產酶具有同步性，48 h內產酶活達到101 U/mL。優化后的培養條件為：接種量為5%，培養溫度為32℃，培養基起始pH值為7，裝液量為50mL。采用此發酵條件產酶活力可達到118 U/mL，較初始條件提高了16.83%[26]。釀酒酵母不能水解淀粉和糊精，利用扣囊復膜酵母的α-淀粉酶基因在釀酒酵母中表達顯得非常重要，這樣構建的重組酒精酵母菌可以利用淀粉為底物一步發酵生產乙醇，這樣就避免了生產和使用商品酶，同時原料的利用率得到很大提高，可為企業減少大量成本，同時可分解淀粉的遺傳重組工程菌是安全可靠的，適合于工業生產。張峰、王肇悅等用同源重組的方式，將由PGK1啟動子、酵母α-因子信號序列，以及扣囊復膜酵母的α-淀粉酶基因編碼區組成的基因表達盒整合到啤酒酵母工業菌株基因組的ILV2位點，使得該啤酒酵母工業菌株在獲得分泌表達α-淀粉高酶活性的同時，具有較低AHAS活性的特征，并且該菌株發酵液中雙乙酰含量也有所降低，所構建的工程菌生物安全性相對較高，具有較高的理論意義和實際應用價值[27]。

2.3 扣復膜酵母產酸性蛋白酶的研究進展

在釀酒業中應用酒用酸性蛋白酶，可在白酒釀造的發酵過程中起協同作用，具有溶解發酵原料、促進微生物繁殖、分解蛋白質生成香味物質、降解酵母菌體蛋白等多種功能，以提高酒的產量和質量，并愈來愈受到人們的重視[28]。目前已發現能分泌酸性蛋白酶的微生物主要是霉菌[29]。扣囊復膜酵母因又稱扣囊擬內孢霉，具有一定霉菌的特性，在一些研究中發現它能產酸性蛋白酶。山下一郎早在1986年就將扣囊復膜酵母可分泌酸性蛋白酶的基因PEPI克隆，并使其在釀酒酵母中得以表達[30]。于欣君等將編碼由扣囊復膜酵母天然產生的酸性蛋白酶的基因（SFAP1）克隆并在解脂耶氏酵母中超表達，產生大量酸性蛋白酶可以使脫脂牛奶凝固，也可以使蝦殼脫蛋白。純化的酸性蛋白酶的最佳pH值和溫度分別為3.5和33℃，并且該酶在1.0±3.0的pH值范圍內非常穩定[31]。

3 釀酒中扣囊復膜酵母對酒風味物質的影響

酯類是一類具有芳香性氣味的化合物，多數呈現果香，是白酒中重要的芳香物質，具有呈香作用，可以在不同程度上增加酒的香氣，并可決定香氣的品質，尤其對白酒香型的歸屬起到重要作用[32]，產香酵母又稱為產酯酵母,主要屬于產酯酵母和假絲酵母,它是中國白酒中酯香的主要產生菌[33]。

產香酵母能夠以乙醇為碳源,既具備乙醇發酵能力又具備醋酸發酵能力,能夠產生以酯香為主的多種香味物質。其可以以糖、醛、有機酸、鹽類為養料,在酯酶作用下合成酯類[34]。生香酵母適用于各種酒的生產,其主要作用是產酯增香,除雜味,改善酒的品質。扣囊復膜酵母具有一定的產香產酯的能力。

和東芹等在棗酒的研制過程中，發現一株適于棗酒釀造的優良酵母茵E9802。該菌株釀制的棗酒具有濃郁的棗香，且酒體豐滿、口感醇和、醇厚。根據其形態、菌絲、繁殖方式、子囊孢子、對淀粉分解及生理生化等幾方面的性能特征，鑒定此菌株為扣囊復膜酵母，并且發現將該菌株釀制的棗酒與其他菌株釀制棗酒對比，發現該扣囊復膜酵母釀制的棗酒中乙酸乙酯的含量明顯高于其他酵母所釀制的棗酒，并且其他酯含量也相對較高[35]。王琨等為改善液態法釀造糯米酒口感淡寡的缺點，在傳統法釀造的基礎上，采取順序接種，即先接種米根霉8-3M進行液化糖化，然后將扣囊復膜酵母菌株3-1Y與YWl2按比例接種以增加酒體芳香類物質種類及量，最后接種釀酒酵母SJ4糯米酒發酵。采用氣相色譜技術對糯米酒樣品的風味物質進行檢測，并對揮發性化合物進行主成分分析。結果表明：當選定釀酒酵母SJ4的接種量為每克糯米接種1×106個細胞，扣囊復膜酵母菌株3-1Y與YWl2的接種比例為3：7（接種量為每克糯米接種1×106細胞）所得到的風味物質含量最優，感官評分最高[36]。羅小葉等采用可培養方法對醬香大曲酵母進行分離、鑒定，共篩選出12株酵母，用高粱培養基對酵母的產香功能進行初篩，通過感官評定確定1株主要產果香味的酵母菌株，被篩選出的酵母經形態學觀察、生理生化實驗及ITS基因序列分析鑒定，確定為扣囊復膜酵母。對產香酵母風味成分進行氣相色譜-質譜聯用儀檢測分析。結果表明，醇類物質相對百分含量提高了51.87%，包括乙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，這些醇類物質共同賦予發酵產物果香味；酯類物質相對百分含量提高了41.39%，包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯呈現清靈果香，其他產物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈現出果香味；還檢測到少量的酚類、酮類、醛類、烷烴類以及少量未定成分的物質[37]。王小丹、陳美竹等采用可培養方法對醬香型白酒大曲中的酵母菌進行計數和篩選，通過形態學特征，生理生化實驗及酵母ITS基因序列分析的分子生物學方法鑒定酵母，并分析酵母的發酵能力和風味成分。結果發現編號FBKL2.0071扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）固態發酵物具有濃郁的果香味，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯含量較高[38]。然釀造的白酒經產酯酵母自身合成的風味物質比添加化學物質更多樣，風味更加豐富獨特，因此越來越多的白酒也用產香酵母增香，使酒體酒質有更大的提高[39]。

4 扣囊復膜酵母在丟糟處理上的應用

白酒丟糟是以高粱、小麥、玉米、谷物等為原料經過固態發酵、蒸餾提取酒精后的殘留物。據統計，我國白酒釀造行業每年產生約2 500萬t的丟糟[40]，白酒丟糟酸度大，水分含量在65%以上，極易腐敗且不易貯存，若隨意丟棄或焚燒，會對環境造成嚴重污染[41]。另一方面，白酒丟糟中殘存著未能完全利用的淀粉、富集的蛋白質、代謝產物氨基酸、維生素、礦物元素、纖維素、無氮浸出物和微生物殘體等營養物質[42]，若能將其及時有效的綜合利用，既解決了環境污染的問題，又可以節約糧食、降低生產成本，進而取得顯著的社會經濟效益。扣囊復膜酵母可以用來發酵糟醅，制備菌體蛋白飼料。祖國仁等為了研究扣囊復膜酵母和產朊假絲酵母混合菌體發酵白酒糟醅的最佳培養條件，發現采用同時接種方式，菌種混合比1∶1，培養溫度30℃，培養基起始pH5,培養時間6 d下發酵產物每克干基酵母細胞數達到24.28億個，粗蛋白含量3.54%,比原料白酒糟粗蛋白含量2.76%提高了47.36%，總糖6.23%，比原料白酒糟總糖含量10.64%，降低了41.45%[43]。盧向陽等以優良菌種117號產朊假絲酵母、136號熱帶假絲酵母、白地霉和扣囊擬內孢霉混合發酵酒糟，生產酒糟單細胞蛋白飼料，他們在發酵前用適量糖化酶預處理酒糟能明顯提高酒糟蛋白質含量，人和成年哺乳動物必需氨基酸及鈣和磷含量明顯增加。發酵最佳培養基為80%酒糟，15%麥麩，3%玉米粉，1%豆餅，1%尿素，0.05%磷酸二氫鉀，最適發酵起始pH為5.0左右[44]。

5 結語

扣囊復膜酵母的高糖化力與高蛋白酶活性以及產酯能力決定了其在制酒工業有巨大的作用，但是國內對于扣囊復膜酵母在釀酒工業的運用還較少，國內對于扣囊復膜酵母的研究主要還是體現在它可高產海藻糖的特性，所以可以嘗試從以下幾方面對扣囊復膜酵母進行改進：

1）扣囊復膜酵母能利用丟糟生產單細胞飼料蛋白等營養物質，可以考慮將其具有營養物質的丟糟再配合一定的糟醅進行新一輪的發酵，或者配以串蒸工藝，使其營養物質能充分利用。

2）在深入研究扣囊復膜酵母和其他菌株特性的基礎上，利用它們的互利關系，取長補短，發揮各自的優勢進行有規律的混合發酵，生產出成本更低，質量更優異的產品將會具有很大的市場空間。

3）由于扣囊復膜酵母產生的淀粉酶具有水解生淀粉的能力，可以考慮利用扣囊復膜酵母進行生料發酵，這將對降低企業的生產成本很有幫助。

4）由于扣囊復膜酵母具有產香產酯能力，而川法小曲白酒由于采用純種根霉加酵母作為糖化發酵劑，難免會有口味寡淡的缺點，如果能將扣囊復膜酵母產香產酯的特性運用于川法小曲酒的釀造中，將會對整個酒質有一個提高與改善。

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Research Progress of Saccharomycopsis fibuligera in Liquor-making Industry

SU Chang，MA Ying-ying，YANG Jian-gang*
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Saccharomycopsis fibuligera belongs to yeast，also known as sac buckle Saccharomycopsis，endomycopsis fibuligera；widely exists in all kinds of yeast，can produce amylase，acid protease in the fermentation industry，beta glucosidase，and its production of enzyme had high activity，in addition the study found that，a lot of Saccharomycopsis fibuligera also has certain aroma producing ester production as well as the use of distiller's ability to produce high quality and low cost of grains of single cell protein feed.In the wine industry in the activity of these enzymes determines Saccharomycopsis fibuligera by all kinds of raw materials as substrates，fermentation of alcohol；the aroma producing ability and increase alcohol ester production in different degree under the condition of aroma，rich flavor of wine.At the same time and it can use distiller's grain production of protein feed，the ability to determine Saccharomycopsis fibuligera has research value and great potential in the brewing industry，this paper summarizes the physiological and biochemical characteristics of Saccharomycopsis fibuligera，strain breeding，application of enzyme producing and aroma producing characteristics and yield of ester producing lees protein feed，provide new ideas and methods for the rational use of Saccharomycopsis fibuligera in the brewing industry.

Saccharomycopsis fibuligera；strain selection；enzyme characteristics；aroma function；distillery protein feed

蘇暢，馬瑩瑩，楊建剛.扣囊復膜酵母在釀酒中的應用研究進展[J].食品研究與開發，2018，39（1）：205-209，220

SU Chang，MA Yingying，YANG Jiangang.Research Progress of Saccharomycopsis fibuligera in Liquor-making Industry[J].Food Research and Development，2018，39（1）：205-209，220

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.040

四川省省屬高校科研創新團隊建設計劃項目（16TD0026）；固態釀造研究四川省院士（專家）工作站（GY2015-03）

蘇暢（1993—），男（漢），碩士研究生，研究方向：發酵工程。

*通信作者：楊建剛（1961—），男（漢），教授，研究方向：釀酒生物技術及應用。

2017-05-15