復蘇周期囊胚移植后完全性葡萄胎與正常胎兒共存病例分析

邵淑敏，李姣，鄒敏，汪文諍，張玲

(華中科技大學同濟醫學院生殖醫學中心/計劃生育研究所，武漢 430030)

患者，女，31歲，因“女方繼發性不孕，男方梗阻性無精子癥，雙側輸精管缺如”在本生殖中心行ICSI-ET助孕治療。女方身高158 cm，體重62.6 kg，BMI 25.08 kg/m2，無不良嗜好，健康狀況良好，無既往病史，無家族病史。平素月經規律，11歲，5～7 d/30～37 d，經量中等，無痛經。女方初婚足月產一子，現健在。2011年再婚后一直同居，有正常性生活，未避孕三年未孕，無流產和早產史。女方基礎內分泌FSH 5.56 U/L、LH 2.98 U/L、E2102.76 pmol/L，竇卵泡計數(AFC)27 個，血型B/Rh陽性，染色體組型46,XX，其他檢查未見明顯異常。男方，28歲，一般體格檢查正常，無既往病史，無家族病史。生殖系統檢查睪丸體積正常，左右輸精管捫及不清，其他無異常。男方基礎內分泌FSH 3.95 U/L、LH 3.69 U/L、E232.00 pmol/L、PRL 5 634.11 mU/L、T 10.96 nmol/L。多次精液常規檢查均未見精子，行雙側睪丸穿刺術可見精子，無任何不適癥狀。血型B/Rh陽性，染色體組型46，XY。

女方促排卵采用長方案，月經周期第21天開始皮下注射GnRH-a(達菲林，輝凌，美國)0.1 mg/d，持續皮下注射14 d后，注射劑量調整為0.05 mg/d，持續皮下注射3 d后通過B超檢測達到降調效果，肌肉注射FSH(普麗康，默沙東，英國)200 U/d啟動Gn，啟動Gn后持續皮下注射GnRH-a 0.05 mg/d；Gn啟動第3 天開始B超檢測卵泡發育，Gn啟動第7 天，調整FSH的肌注量為100 U/d，并增加肌注75 U/d HMG(珠海麗珠)，Gn啟動第9 天，Gn總量為1 700 U，其中FSH 1 400 U、HMG 300 U，B超顯示獲得18～20 mm以上的優勢卵泡5 個，血激素水平LH 2.46 U/L、E219 003.26 pmol/L、P 3.02 nmol/L，內膜厚度9 mm，內膜類型為A型，當晚20：00點肌肉注射10 000 U HCG(珠海麗珠)，HCG肌肉注射后36～37 h在陰道B超引導下取卵，獲取23 個卵母細胞，并將卵母細胞置于受精培養液中(G-IVF PLUS，Vitrolife，美國)暫時培養。

男方于取卵日行睪丸穿刺術獲取精子，用20 ml注射器針頭抽吸睪丸組織，并置于盛有精子洗滌液(SpermRinse，Vitrolife，美國)的培養皿中，用針頭將組織撕碎，倒置顯微鏡下檢查有無精子，每高倍鏡視野下偶見精子，未見活動精子，精子形態正常。將撕碎的睪丸組織350g離心10 min，棄上清，在沉淀上加0.2 ml精子洗滌液(SpermRinse)，獲得的精子置于室溫下待用。卵母細胞暫時培養2 h后，用透明質酸酶(Sigma，美國)消化法脫去卵周圍大部分顆粒細胞，觀察卵母細胞的成熟度。22 個MⅡ卵行ICSI，胚胎培養第1 天觀察受精情況，10 個正常受精卵(2PN)、4個異常受精卵(1PN)、8個未受精卵(0PN)；胚胎培養第3 天共獲得9 個優質胚胎，移植2 個胚胎(評分為8Ⅱ、8Ⅱ)，冷凍6 個卵裂期胚胎。正常受精剩余2 個和1PN來源4 個胚胎行囊胚培養，胚胎培養第6 天，2個1PN來源的卵裂期胚胎形成2 個優質囊胚行冷凍保存(評分為4CB、4CB)。胚胎移植術后常規用藥，胚胎移植術后14 d測定血清中尿β-HCG值為1.63 U/L，未妊娠。

2015年5月行人工周期凍融胚胎移植(FET-ET)，從月經周期第2 天開始口服補佳樂(拜耳，德國)4 mg/d，月經周期第12 天左側卵巢有1個0.8 cm×0.7 cm卵泡，內膜厚度為5.5 mm，根據內膜情況和血激素水平調整補佳樂劑量為6 mg/d，月經周期第16 天調整補佳樂劑量為8 mg/d，并監測LH峰，月經周期第19天，補佳樂使用天數18天，總量96 mg，內膜厚度為7 mm，肌肉注射黃體酮(珠海麗珠)40 mg進行內膜轉化，內膜轉化第6天移植2 個4CB囊胚(1PN來源)。移植后肌肉注射黃體酮60 mg/d，補佳樂維持原劑量。移植后14 d測定β-HCG值為1 358 U/L。移植后28 d，B超顯示：宮內單活胎早孕，囊內可見卵黃囊，胚芽可探及和原始心管搏動血流信號；另可見一無回聲區，內未見明顯卵黃囊，孕囊周邊可見非純液性暗區。移植后34 d，患者陰道間斷流血入院保胎治療，漸出現惡心、嘔吐，伴腹脹，并逐漸加劇。2015年7月復查三維彩超顯示：宮腔右側可見一成形胎兒，可見胎動及胎心搏動；宮腔左側可見12 cm×6.8 cm高回聲光團，內可見蜂窩狀大小不等的無回聲，邊界清晰，光團周邊可見豐富的血流信號。超聲提示：單胎存活合并葡萄胎，卵巢黃素囊腫。患者腹脹加劇，呼吸困難，血壓持續增高，轉入上級醫院治療。轉院后查血β-HCG>1×106U/L；B超：宮腔內見一成形胎兒，可探及胎心；宮腔左側見不均勻增高區，內在散在無回聲區，呈蜂窩狀。CT：兩側胸腔積液、縱隔內，兩側腋窩多發淋巴結顯示。孕11+5周確診為宮內早孕合并滋養層細胞疾病，并給予對癥治療，行葡萄胎負壓吸宮術+鉗刮術。病理組織提示：見滋養層細胞增生，絨毛間質高度水腫，間質內無胎源性血管，為完全性葡萄胎。術后第2 天開始第1 個療程化療，連續化療4 個療程，術后2個月β-HCG降至正常，繼續鞏固化療3 個療程，至今未復發。

討 論

根據細胞遺傳學分類，將葡萄胎分為部分性葡萄胎(PHM)和完全性葡萄胎(CHM)，PHM是由一個單倍體卵母細胞和兩個單倍體精子受精，或由一個單倍體卵母細胞和一個減數分裂缺陷的雙倍體精子受精而成，其染色體核型90%以上為三倍體，合并存在的胎兒也是三倍體，通常三倍體的胎兒在孕期前3 個月就不能存活。CHM是由一個細胞核缺如或失活的卵母細胞與一個單倍體精子受精，或有一個失活的卵母細胞分別和兩個單倍體精子同時受精而成，其染色體核型為二倍體，均為父本來源，不能形成胎兒[1]。在臨床上，完全性葡萄胎與胎兒共存(CHMCF)的發生率為1/22 000～1/1 000 000，其胎兒有可能繼續存活，但是易出現流產、早產、產前子癇等并發癥[2]，其真正的發病原因目前尚不清楚，促排卵或醫源性多胎是否造成CHMCF發病率增加，目前也尚無定論。

多篇文獻報道ART治療后發生妊娠滋養細胞疾病，均為個案報告，主要是集中在IVF/ICSI-ET后，可能與精子/卵母細胞異常、促排卵刺激、負壓抽吸取卵、胚胎質量、技術操作、體外培養等因素有關[3]。個別文獻報道是使用促排藥之后，研究發現79%的多胎合并CHM患者曾服用促排卵藥物，這可能與促排卵藥物增加異常卵母細胞發生率有關[4]。在本病例中，移植的2 枚囊胚均來源于ICSI的1PN胚胎。ICSI受精是將單個精子注射入卵胞質內，受精16～18 h后，卵母細胞內出現2 個原核(2PN)，并且卵周間隙內有2 個極體，被認為正常受精；但仍有一部分卵母細胞出現1 個原核(1PN)和多個原核(≥3PN)，則被認為是異常受精。ICSI的異常受精可能與卵母細胞質量差、精子缺陷等有關；對于含有2個極體但只有1PN的合子，可能是極體碎片化造成的誤判，ICSI前對卵母細胞進行脫顆粒細胞時就已經形成了極體的碎片化，且這種卵母細胞受精后也不能形成雌原核或雄原核[5]。研究表明，IVF受精形成的1PN受精卵通常是二倍體的，且50%含有Y染色體[6]，1PN來源的囊胚仍可以保持足夠的維持妊娠率；但ICSI中1PN來源的囊胚則不能維持妊娠[7]。研究發現ICSI受精形成的1PN受精卵，僅有10%含有Y染色體，說明來源于ICSI受精的1PN合子可能不是精卵受精形成的，但其形成機制目前尚不清楚。有研究認為可能是在細胞分裂中期，通過電融合細胞核的方式成為一個完整的合子，進而形成一個單倍體胚胎，通常與延遲排卵和卵母細胞過熟等因素有關[6]。但也有研究持相反的理論，認為來源于ICSI的1PN胚胎中有27.9%是具有雌原核和雄原核的二倍體的胚胎，ICSI受精后8～10 h可觀察到原核發育不同步的現象，認為1PN合子是由于原核觀察時兩個雌、雄原核發育速度不同步或過早融合造成的。同時，ICSI中1PN合子形成的卵裂期胚胎的單倍體發生率明顯高于IVF(31.2% vs 3.1%)，且所有的卵裂球均只檢測到Y染色體，認為雄原核激活、雌性基因組完全被排除與單原核形成有關[8]。但有研究則認為ICSI的1PN合子的單個原核攜帶母源和父源的兩套基因組，是在受精過程中原核形成失調引起的[9]。

正常受精和異常受精卵裂形成的胚胎都可能存在染色體異常，尤其是異常受精的胚胎，非整倍體和嵌合體的發生率較高，胎兒畸形和葡萄胎的出現明顯增多[10]。ICSI來源的1PN胚胎存在染色體異常，約占70%[8]，也有研究指出ICSI來源的1PN胚胎均為染色體異常的胚胎，因此葡萄胎可能來源于ICSI的1PN胚胎。近年來有多個研究報道ICSI后發生葡萄胎妊娠的病例，與本病例相同的文獻報道指出移植2 個ICSI胚胎(2PN和1PN胚胎各1 個)后形成葡萄胎和正常胎兒共存，推斷1PN來源的異常受精胚胎是造成葡萄胎的原因，認為移植1PN來源的胚胎有一定的風險[11]。但有文獻報道移植3 個ICSI的2PN胚胎，也形成CHM和正常胎兒共存的雙胎妊娠，且遺傳分析發現CHM的基因組來源于一條單個精子的重復，二倍體精子受精或精子DNA核內再復制是引起葡萄胎妊娠的原因[12-13]。在 ICSI胚胎形成的葡萄胎組織中，檢測到父源二倍體基因組，認為可能是由于單倍體父源基因組再復制后和一個失活的卵母細胞受精，或者是二倍體精子和一個失活的卵母細胞受精造成的[14]。此外，移植ICSI后的第3天凍融胚胎也有形成PHM的病例報道。ICSI-ET后形成葡萄胎的染色體均為父源性，沒有母源性染色體，是精子DNA核內再復制成二倍體或二倍體精子受精等引起的，因此ICSI技術的單個精子受精并不能完全防止葡萄胎妊娠的發生，ICSI技術操作的精子選擇或機械損傷對ART葡萄胎形成的潛在影響還需進一步探討[15]。

來源于ICSI的1PN合子可能是受精過程中原核形成異常造成的，引起第一次有絲分裂和染色體分離異常，導致形成染色體異常的胚胎。ICSI來源的1PN胚胎染色體異常比例較高，染色體正常率僅約為25%。雖然文獻報道染色體異常比例結果不一致，但大部分研究認為囊胚培養可篩選一部分較強發育潛能和染色體正常的胚胎，提高胚胎利用率和累積妊娠率。此外，1PN胚胎也有可能是原核發育不同步或過早融合造成的，若1PN卵裂期胚胎能形成囊胚，則可認為其染色體正常的機率較高，可用于冷凍和移植。本例患者移植1PN囊胚后形成葡萄胎，相似臨床病例認為1PN胚胎有可能與葡萄胎形成有關，75%的染色體異常的胚胎也能形成質量較好的囊胚，囊胚培養并不能篩除染色體異常的胚胎，為提高輔助生殖技術的安全性，對于ICSI后形成的1PN胚胎應予以廢棄[9]。同時，本文認為IVF來源的1PN胚胎也不應該作為首選的移植胚胎，若需移植1PN胚胎，可以通過植入前遺傳學篩查排除染色體異常后再行移植。