人類微量精子冷凍方法的研究進展

邵帥，洪樂鵬，江梅，丁濤，姜經航，曹玉平，蔡麗麗，鄧艷琴

(1.湖北省荊門市第二人民醫院生殖醫學科，荊門 448000；2.廣州醫科大學人體解剖教研室，廣州 511436；3.湖北省荊門市第二人民醫院婦科，荊門 448000)

世界范圍內由于男性不育問題導致的不育大約占40%～50%[1]，而無精子癥大約占男性不育問題的10%，影響著全世界1%的男性人群，而且無精癥的發生率會逐漸升高[2]。無精子癥患者在以前是無法擁有自己遺傳學意義上的孩子，而隨著輔助生殖技術的發展，無精子癥患者可以通過經皮附睪精子抽吸術(PESA)、睪丸切開取精子術(TESE)、顯微睪丸切開取精術(MESE)等技術來獲取少量的精子[3]，再通過卵胞漿內單精子注射(ICSI)將精子注射到卵母細胞中，最后將形成的胚胎移植到女性宮腔內獲得臨床妊娠。無精子癥患者通過PESA、TESE、MESE等手術取精和ICSI相結合的技術成功生育的報道早已屢見不鮮[4-5]。對于無精子癥患者來說，通過手術獲取的少量精子不僅意義重大，而且也極其珍貴，而在ICSI后保存剩余的精子不僅可以避免多次手術取精導致的血睪屏障受損以及性功能損害，而且還可以減輕患者的心理壓力和經濟負擔[6]。

常規精液冷凍保存程序中離心和清洗不僅會導致精子的丟失而且容易造成精子損傷，研究顯示常規精液冷凍睪丸精子的復蘇回收率只有1%[7]，所以不能用于微量精子的冷凍。除此之外，手術取精獲得的精子數量少，精子頭部DNA不夠穩定，細胞膜也未成熟完全，所以常規方式冷凍效果很差。因此，找到合適的冷凍方法以及合適的冷凍載體，提高微量精子冷凍后的復蘇率、存活率就顯得極其重要。本文就近年來人類微量精子冷凍方法(空透明帶冷凍、液滴冷凍、Cryoloop冷凍、麥管冷凍法等)作一綜述。

一、空透明帶冷凍

透明帶是包繞在卵母細胞外的一層糖蛋白，在卵子發生、卵子保護、阻止多精受精中發揮著重要的作用[8]。運用顯微操作技術清除透明帶內容物，然后用ICSI顯微注射針將少量精子注入到空透明帶內。顯微操作處理時可以通過激光破膜或者機械破膜，留在透明帶上孔的大小也會影響精子冷凍，小孔會增加遺留宿主DNA片段的風險，而這些DNA片段會粘附到精子上，并隨著ICSI注射到卵母細胞內，引發倫理學爭議；大孔可以將胞質內容物清除干凈，但也容易造成精子丟失，用石蠟油封口時會降低解凍復蘇后精子的回收率[9]。有研究表示將含有卵黃和甘油的冷凍保護劑在精子注射前預先填充到卵母細胞內能夠防丟失，而且有很好的冷凍的效果[10]。

空透明帶冷凍可以明顯提高精子冷凍復蘇回收率，維持精子的運動性、染色質和DNA完整性[11]，研究顯示透明帶冷凍精子凍融回收率為88.3%，ICSI活動精子的受精率達到60%[7]，說明空透明帶冷凍對精子的損傷較低，可以為微量或單個精子的冷凍提供很好的保護。Walmsley等[12]報道1997年誕生了第一例用空透明帶冷凍睪丸精子受精成功的嬰兒，5個周期中3個懷孕，并且其中的2個為雙胞胎。該報道3年后也有研究用人的空透明帶冷凍單個附睪精子同樣獲得妊娠[13]，這對于稀少或單個精子來說是極好的冷凍方法。

空透明帶的來源為人和動物的透明帶(主要為小鼠和倉鼠透明帶)，人的透明帶冷凍精子的凍融回收率和受精率均低于小鼠透明帶冷凍，這與人類精子容易和透明帶上的ZP3結合發生頂體反應有關[13]。盡管透明帶冷凍的復蘇回收率在75%以上，但仍然存在一些問題，比如人的透明帶來源比較受限，動物來源的透明帶容易和人類精子相互作用受到一定的倫理爭議，兩者均無法避免外來異源性蛋白污染，而且受到法規和倫理問題的限制。

二、微滴冷凍法

1.快速微滴冷凍法：將含有精子和冷凍保護劑混懸液的液滴滴在培養皿或冷凍管里，液滴上覆蓋礦物油，待培養皿或冷凍管放在液氮上熏蒸后，投入液氮中冷凍保存，該法冷凍回收率比較好。Bouamama等[14]用ICSI將100個精子和冷凍保護劑(CPA)制成0.5 μl的液滴保存在覆蓋有石蠟油培養皿中，將培養皿用封口膜封好后放在液氮蒸汽上熏蒸2個小時再放到液氮中，解凍后精子的回收率為100%，運動率為50%。張靜靜等[15]通過比較快速微滴冷凍法和常規冷凍法，發現冷凍后精子的活力、DNA損傷之間無統計學差異。

快速微滴冷凍也可以用于單個精子冷凍，Quintans等[16]將4～6個精子與CPA混勻保存在覆蓋有石蠟油培養皿的液滴中，將培養皿用封口膜封好后水平冷凍在液氮罐中，解凍后發現其精子的回收率為90%～100%。其他研究運用相同的技術保存睪丸穿刺的精子，冷凍后精子的回收率為100%，解凍后67%的精子保持冷凍前的活力，ICSI后51個卵中9個受精，移植3個后其中的1個獲得妊娠[14，17]。

2.微滴玻璃化冷凍法：另一種方法是直接將精子和冷凍保護劑或者不加冷凍保護劑的液滴入液氮凝固成微滴，然后收集到冷凍管中，最后將冷凍管中投入液氮儲存保存。該方法精子凍存體積小，不會粘附載體，精子回收率成效顯著。Isachenko等[18]研究發現將精子和冷凍保護劑混勻后以30 μl 每滴滴入液氮中，然后收集到冷凍管中投入液氮保存，結果顯示：與不加冷凍保護劑相比，加冷凍保護劑組的解凍后精子存活率較高，且能保護線粒體膜電位；而馬超等[19]通過超快速冷凍比較冷凍保護劑對人類微量精子冷凍的影響，發現添加冷凍保護劑和不添加冷凍保護劑的精子解凍后回收率、存活率以及活動率均無統計學差異。葛斌等[20]通過比較無保護劑的微滴玻璃化冷凍法和慢速冷凍法，發現兩種冷凍方法受精率、卵裂率、妊娠率和流產率均無統計學差異，但優胚率高于慢速冷凍；梗阻性和非梗阻性精子微滴法冷凍復蘇率均大于60%，精子復蘇后女方的妊娠率均為40%[21]。

不管是快速微滴冷凍法還是微滴玻璃化冷凍法都有一定的局限性，微滴直接滴入液氮中，容易增加交叉污染的風險，而在培養皿中保存微滴凍存時容易受到尺寸大小的影響而導致保存的不便。

三、Cryoloop冷凍

Cryoloop由冷凍蓋、管、不銹鋼桿和尼龍環組成，利用虹吸原理可以將少量的精子保存在尼龍環上。Cryoloop一開始用于胚胎的冷凍，之后才用于稀少或單個精子的玻璃化冷凍。Schuster等[22]和Desai等[23]將Cryoloop和常規慢速冷凍結合起來保存極少量的精子，發現Cryoloop法解凍后精子丟失非常少，可以忽略不計。Desai等[23]用該方法評估精子的功能時發現將保存在Cryoloop上的精子解凍后注射到人的卵母細胞內，卵母細胞能夠正常對精子的頭部去凝縮，并且有原核形成。

Desai等[23]認為Cryoloop可以可替代倉鼠透明帶來冷凍單個精子，用ICSI針將精子直接放到冷凍保護劑形成薄膜的尼龍環上保存，精子解凍后與常規載體冷凍保存者無明顯差異，單個精子冷凍后精子活力達73%；將2～8個附睪精子和睪丸精子裝載到尼龍環上進行液氮蒸汽熏蒸后放入液氮中保存，解凍后精子回收率為72%，解凍后精子頭部輕微擺動，但是尾部擺動比較靈活，附睪和睪丸的精子注射到卵母細胞內均獲得受精卵。也有研究發現Cryoloop冷凍可以保持精子頭部染色質濃縮以及完整性[24]。

Cryoloop作為一種非生物性載體比較安全，可以解決許多空透明帶冷凍帶來的問題，精子和尼龍環接觸面積比較小可以阻止精子粘附，而且省去了離心步驟，可以最大限度保存精子，說明Cryoloop對于冷凍極少量的精子是非常有用的載體。Cryoloop最大的缺陷就是一種開放性儲存系統，精子直接與液氮接觸，增加了交叉污染的風險。

四、麥管法冷凍

微型麥管法是用胚胎冷凍麥管在無菌條件下切成2.5 cm長的部分，一端用塑料塞封閉，將15～20 μl的精子混懸液通過顯微操作針注射到微型載桿中，另一端也用塑料塞封閉。5～6個微麥管放到冷凍管中，冷凍管在液氮蒸汽上熏蒸30 min后投入液氮保存。ICSI時只需解凍冷凍管中的一個微型載桿，并不影響剩余的微型載桿冷凍，也不影響精子的活力和受精率[25]。王乃輝等[26]比較了超微量冷凍麥管與1.8 ml冷凍麥管和0.25 ml冷凍麥管，發現超微量冷凍麥管能夠明顯提高睪丸精子的冷凍復蘇率。

Vicdan等[27]使用常規麥管法冷凍TESE獲取的克氏綜合征患者的精子與新鮮精子比較，發現兩者的受精率分別為48.3%和52.7%，而臨床妊娠率分別為60%和51.6%，兩者均能獲得相同的妊娠率。Isachenko等[28]使用常規冷凍麥管和拉細開放式冷凍麥管來冷凍0.5 μl的精子懸液，為形成封閉式冷凍系統，防止液氮中交叉污染，將拉細開放式冷凍麥管放入另一個90 mm的麥管中變成封閉性載體。吳穎等[29]應用MAPI 系統將精液分裝到CBS高安全性麥管中，不僅不影響冷凍效果，而且能夠防止交叉污染，特別適用于稀少精子保存。鑒于開放式麥管的不安全性，封閉式冷凍麥管隨之誕生，2012年Desai等[30]用一種封閉式冷凍麥管HSV通過慢速冷凍來保存附睪或睪丸的微量精子，解凍復蘇后精子回收率為33%～100%，ICSI 注射到6個成熟卵中均獲得受精，移植后成功妊娠。該方法能夠避免精子與液氮以及其他物質接觸，可以防止交叉污染。使用麥管作為載體冷凍少量精子簡單有效，而且容易操作。目前麥管適合冷凍少量的精子，并不適合冷凍嚴重損傷或者未成熟精子，由于該方法冷凍時精子容易粘附到管壁上造成精子丟失，更不適合冷凍單個精子。

五、顯微操作針法冷凍

使用ICSI 針作為無菌載體來冷凍單個精子早已被提及和建議[30]。Sohn等[31]使用ICSI 針來冷凍少弱精子癥患者的精子，慢速冷凍和超快速冷凍方法解凍后精子的回收率分別是90.1%和79.6%，存活率分別為28.8%和8.2%。Kuznyetsov等[32]比較了極體活檢針和拉細麥管的微量精子冷凍效果，結果顯示冷凍復蘇后極體活檢針和拉細麥管的精子復蘇率分別為87%和73%，極體活檢針冷凍有明顯的優勢。使用顯微操作針作為載體來冷凍單個精子簡單有效，但是不適合長期保存，因為顯微操作針針尖比較脆，容易破碎，而且精子容易直接暴露在液氮中，增加了交叉感染的風險。

楊志勇等[33]用快速冷凍和液氮熏蒸來比較剝卵針冷凍微量精子的冷凍效果，將精子裝載到剝卵針里，礦物油封閉載體兩端，快速冷凍(將剝卵針直接投入液氮中保存)和液氮熏蒸(將剝卵針在液氮蒸汽熏蒸30 min后投入液氮保存)冷凍精子的復蘇率分別為(55.9±11.0)%和(36.3±9.8)%，精子活力分別是(36.64±8.7)%和(23.48%±6.2)%，該方法簡單、有效，可以避免液氮中交叉污染。

六、團藻球

團藻球是由團藻藻類聚集形成的球形菌落，用持卵針固定球形結構，用ICSI 針將活動精子注射到球形結構中，將包含精子的團藻球置于冷凍保護劑中后裝載到麥管中，麥管經液氮蒸汽熏蒸后投入液氮保存；解凍麥管后，用ICSI 針將精子從團藻球中取出。盡管解凍后精子的回收率為100%，活力約為60%[34]，該冷凍方法還是存在一定的缺陷：精子暴露在藻類的生物材料中，ICSI時容易將粘附在精子上的生物材料注射到卵母細胞內。而美國食品和藥物管理局新的規定以及歐盟組織指令規定非人體的生物材料的團藻不能用于臨床，這使得用團藻球冷凍精子受到極大的限制。

七、瓊脂糖微球

瓊脂糖微球是用2%的瓊脂糖微球作為一種非生物的類似的透明帶。預先將少量精子在冷凍保護劑中平衡，通過顯微操作將精子裝載到每個瓊脂糖微球中，然后瓊脂糖微球裝入塑料麥管中，最后麥管經液氮蒸汽熏蒸后投入液氮保存。Hatakeyama等[35]將26位男性的2 142條活動的精子置于702個瓊脂糖微球中進行冷凍保存，解凍后63%精子保持活力，精子活動率為20%～95.1%。而在瓊脂糖微球冷凍單個精子時，分別將微球放在聚碳酸脂板和金屬片上進液氮熏蒸，兩者的精子回收率分別為91.5%和98.3%，精子存活率分別為97.3%和91.4%，均表現出優異的冷凍效果[36]。瓊脂糖微球作為冷凍少量精子的新型非生物載體，可以作為一種潛在臨床應用的載體。

八、堅硬表面玻璃化法(SSV)

堅硬表面玻璃化法將少量的精子和冷凍保護劑(CPA)混勻，取50 μl或100 μl的精子混懸液裝在毛細管中，在干冰表面或冷凍的金屬表面進行迅速降溫形成冰凍的小液滴，然后轉到液氮中保存。SSV法迅速降溫可以防止細胞內冰晶的形成，由于玻璃化過程發生在毛細管內，可以保證精子的迅速解凍。Satirapod等[37]研究顯示SSV法與慢速冷凍相比，精子活力、能動性無顯著差異，但SSV法中的精子DNA損傷率和尾部缺陷明顯少于慢速冷凍法。Gil-Salom等[38]成功應用這種方法保存睪丸精子，解凍后通過ICSI授精，發現其臨床妊娠率以及移植率與新鮮睪丸精子的效果一樣。

九、Cell Sleeper法

Cell Sleeper作為一種非生物活性的新型冷凍載體，被證明是一種潛在的非常適合冷凍單個精子的載體。Endo等[39]將精子保存在Cell Sleeper中進行玻璃化冷凍，復蘇后回收率為83%，通過ICSI將精子注射到6個卵母細胞中，5個形成原核，胚胎形成率為100%，移植后成功分娩。Endo等[40]在接下來的研究比較了Cell Sleeper和 Cryotop法的冷凍效果，發現兩組之間的精子能動性和活力均無顯著差異。Coetzee等[41]將無精子癥患者的單個睪丸精子保存在Cell Sleeper中進行快速低溫冷凍，解凍后注射到卵母細胞中，179個卵母細胞的受精率為 65.9%，每個周期的妊娠率為58.3%，其中4個周期妊娠并繼續妊娠超過20周。

微量精子冷凍技術的運用為少弱精子癥以及無精子癥患者提供了極大的幫助，增加了他們生育的希望和信心。除了上述冷凍方法，還有Cryotop、海藻酸滴法、薄片法、新冷凍片法等。雖然在冷凍方法上已取得了一定的進展，但這些方法在冷凍時或多或少都存在一定的缺陷，需要考慮保持精子的DNA完整性以及避免線粒體膜損傷等，這就需要更多的實驗研究來探尋合適的冷凍方法、載體以及冷凍保護劑等，從而達到簡便方便、回收率高、精子完整性好以及無交叉污染風險的微量精子冷凍方法。