乙型肝炎病毒相關性肝癌組織維生素D受體表達情況分析

李玉苓，郭文征，張衛民，孫韜，趙彩彥

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第五大常見腫瘤，位列癌癥死亡原因的第2位，每年約有一百萬人死于HCC[1]。另外，HCC具有發病隱匿、生物惡性程度高、生存期短及對放、化療均不敏感等特點，預后差，目前臨床治療不樂觀。近年來，維生素D（ vitamin D，VD）的抗腫瘤作用日益受到重視[2]。研究發現，維生素D可發揮抑制細胞增殖、誘導細胞調亡和分化等抗腫瘤作用[3]。維生素D生物學效應主要由細胞內特異性的維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）介導。本研究通過檢測HCC患者肝癌組織及其癌旁組織VDR mRNA水平及其VDR蛋白表達，并與正常肝臟組織比較，以探討維生素D在HCC發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年3月～2014年11月就診于河北醫科大學第三醫院接受肝移植的HCC患者10例（均有乙型肝炎肝硬化基礎），男7例，女3例；年齡28～72歲，平均年齡（44.3±11.2）歲。診斷符合2011年版《原發性肝癌診治規范》的診斷標準，分別取HCC患者癌組織及其癌旁組織。所有HCC患者血清HBsAg陽性。排除標準：（1）合并甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒、EBV、CMV、HIV 感染；（2）伴有酒精性肝病、自身免疫性疾病、藥物性肝損傷、心血管疾病；（3）妊娠；（4）其它系統嚴重疾病患者。另外選取同期肝移植供體4例，男3例，女1例；年齡20～56歲，平均年齡（31.5±11.7）歲，分別取其正常肝組織。

1.2 肝組織VDR檢測 采用Power Vision TM二步免疫組化法檢測肝臟組織VDR表達。主要步驟如下：（1）脫蠟；（2）抗原修復；（3）在切片上加 3%H2O2，于37℃溫育箱中孵育15 min，以封閉非特異性抗原，PBS緩沖液洗5 min×2次；（4）滴加兔抗人VDR多克隆抗體，置于冰箱中4℃過夜，室溫下復溫30 min，加0.01 M PBS緩沖液洗5 min×2次；（5）滴加山羊抗兔IgG，置于37℃孵育40 min，加0.01 M PBS 緩沖液洗 5 min×2次；（6）加 3，3'- 二氨基聯苯胺（3，3’-Diaminobenzidine，DAB）顯色，時間約1 min；（7）自來水沖洗，終止顯色，加蘇木素復染，時間約為2 min，在分化液中浸泡30 s，再在返藍液中浸泡30 s，常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察結果，細胞被染成棕黃色為陽性細胞。

1.3 肝組織VDR mRNA水平檢測 采用實時熒光定量PCR法（美國Invitrogen公司Trizol試劑），提取肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，在Taq DNA聚合酶作用下合成PCR產物。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）作為內參照基因。GAPDH 上游引物：5’-AACAGCCTCAAGATCAGCAA-3’， 下 游 引 物 ：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’，擴增片段長度 149 bp；VDR 上游引物：5’-ACCAGAAGCCTTT GGGTCTG-3’，下游引物：5’-CGTTCCGGTCAAAG TCTCCA-3’，擴增片段長度110 bp。PCR反應參數：95℃預變性2 min，進入擴增循環，95℃變性15 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 40 個循環。根據待測基因與管家基因的Ct值，用 RQ 值（2-ΔΔCt）表示待測基因的相對水平[3]。

1.4 肝組織VDR蛋白表達檢測 采用Western blot法，兔抗人VDR多克隆抗體購于艾菲生物技術有限公司（Catalog：AF6159），抗 GAPDH 抗體購于美國Bioworld公司。提取肝組織蛋白，電泳、轉膜、封閉后，先后加一抗、二抗，行化學發光反應、曝光、顯影，掃描圖片。應用Image J軟件測定各條帶灰度值，以計算VDR蛋白與GAPDH灰度比值作為VDR蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以（±s）表示，先進行方差齊性檢驗。對正態分布資料，采用單因素方差分析，組間比較采用 Student-Newman-Keuls法檢驗，對非正態分布資料，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用Pearson直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝組織VDR蛋白表達情況 VDR在所有HCC患者的癌組織及正常肝臟組織均表達，主要在細胞質表達，細胞核中基本無表達（圖1和圖2）。

圖1 正常肝組織VDR表達情況（Power Vision TM，200×）

圖2 肝癌組織VDR表達情況 （Power Vision TM，400×）

2.2 肝組織VDR mRNA及其蛋白水平比較 10例癌組織VDR mRNA水平為（2.77±0.30），顯著高于癌旁肝硬化組織（1.62±0.21）或正常肝組織（1.57±0.19），差異具有統計學意義（P＜0.01，圖 3）；Western blot檢測結果顯示，HCC組織VDR蛋白表達水平（1.15±0.57）顯著高于癌旁肝硬化組織（1.02±0.25）或正常肝臟組織（0.37±0.11），差異具有統計學意義（P＜0.01，圖 4）。

圖3 各組肝組織VDR mRNA水平比較

圖4 各組肝組織VDR蛋白表達水平比較

3 討論

VDR是類固醇激素／甲狀腺激素受體超家族成員，分為膜受體（menbrance vitamin D receptor，mVDR）和核受體（nuclear vitamin D receptor，nVDR）兩類。膜受體主要負責維持鈣磷平衡，而核受體本質是一種配體依賴的核轉錄因子，通過與活性維生素D3結合形成激素-受體復合物，該復合物與相應目的基因啟動子區域的作用元件結合，從而啟動或抑制該基因的轉錄活性，調節結構基因的表達，影響組織細胞增殖分化及其相應的生物學功能，這是維生素D發揮作用的基因途徑。維生素D生物學作用還有非基因途徑，主要表現有以下幾方面：促使胰島B細胞分泌胰島素，調節腸道上皮細胞對鈣離子的吸收，調節成骨細胞中電壓門控的鈣離子和氯離子通道的開放以及內皮細胞的遷移等。

腫瘤形成是一個復雜的多因素作用的過程，主要由環境因素和基因特性決定[4]。維生素D抗腫瘤已證實的機制主要有以下幾方面：（1）調控細胞周期：腫瘤是一類細胞周期疾病，細胞周期的失控是影響細胞惡變的重要因素，維生素D可以將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，導致S期細胞數目下降，致使G0～G1期細胞堆積，而G2～M期的細胞數目相對無變化[5]，從而抑制腫瘤細胞增殖；（2）誘導細胞凋亡：細胞調亡是調節細胞正常生長和分裂的重要過程，與細胞周期密切相關。研究發現人類脂肪酸輔酶A連接酶（fatty acid coaligase，FACL）屬于脂酸代謝酶家族，FACL可促進花生四烯酸等長鏈脂酸形成脂酸輔酶A，而花生四烯酸輔酶A可通過激活Caspase-3通路誘導細胞凋亡，并且由于花生四烯酸的堆積，會抑制這種促凋亡作用，以至于停止，因此過度表達的FACL可以降低細胞內花生四烯酸水平，從而阻止促凋亡作用[6]；（3）影響生長因子和激素：1,25（OH）2D3及其類似物與VDR結合，形成激素-受體復合物，該復合物作用于靶基因，上調類胰島素生長因子結合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs）表達，從而降低了類胰島素生長因子（insulin-like growth factor IGF）活性，阻斷IGF促進細胞分裂的作用[7]，達到抗腫瘤目的；（4）抑制端粒酶的活性：1,25（OH）2D3 可以明顯降低端粒酶的活性，影響腫瘤細胞周期[8]，進而對腫瘤細胞增殖產生抑制作用。另外，端粒酶活性的降低能進一步協同1,25（OH）2D3對HCC細胞發揮促凋亡作用；（5）非基因途徑：核轉錄因子p65可以調控細胞內信號轉導，而基質金屬蛋白酶是作用于腫瘤侵襲轉移過程的蛋白水解酶。盛茂林等[9]發現維生素D類似物EB1089發揮抗腫瘤作用是通過非基因途徑的雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）介導，主要表現為下調核轉錄因子p65（nuclear transcription factor p65，NF-κB p65）和基質金屬蛋白酶 -9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）表達，從而影響細胞內信號轉導，抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，并且抑制其侵襲轉移。另外，DNA損傷及抗氧化酶活性降低可以導致腫瘤的發生，維生素D可以通過阻止DNA損傷、恢復抗氧化酶活性來抑制腫瘤的產生[10]。自吞噬是調控細胞內容物降解和再循環的過程，可以抑制細胞生長。維生素D還可以誘導腫瘤細胞的自吞噬[11]，而自吞噬基因編碼的蛋白Beclin-1又能增強維生素D誘導的自吞噬作用[12]，從而抑制腫瘤細胞生長。

維生素D抗腫瘤作用的發揮主要是通過與細胞核內的VDR結合實現。多項研究表明維生素D對許多組織細胞VDR蛋白有上調作用，但是在VDR mRNA水平的調節卻比較復雜，既可以表現為向上調節，也可以無調節作用，對于部分細胞甚至可以產生下調作用，具有明顯的組織細胞特異性[13]。VDR屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，廣泛分布于機體各組織細胞中，比如癌變的乳腺、垂體、甲狀旁腺等部位[14]。不同癌組織VDR表達是有差異的，但目前對腫瘤組織VDR表達水平的意見還未達成一致。關于VDR在癌組織中表達的研究主要集中在乳腺癌和結腸癌。Ditsch et al[15]研究納入82例乳腺癌患者，分析發現VDR高表達患者與VDR低表達者比，具有更長的整體生存期和無惡化生存期。然而，Eisman[16]研究報道乳腺癌組織VDR表達與正常乳腺組織無明顯差異，并且發現約80%乳腺癌組織細胞核中都有VDR表達。檢測結腸癌組織VDR時發現，癌組織VDR陽性率為32%，正常粘膜組織為89%[17]。VDR在正常粘膜組織的表達明顯高于癌組織，并且VDR均表達于細胞核內。最近的研究發現VDR除存在于細胞核內，在某些細胞還存在于細胞質及細胞膜中[18]。也有研究者先后在多種肝癌細胞系中發現VDR表達[19]，提示肝癌細胞可能是維生素D和VDR作用的靶細胞，VDR基因可能是肝癌的易感基因。研究發現與正常肝臟組織比，HCC組織VDR表達增強[20]。在本研究中，我們對HCC組織、癌旁組織和正常肝組織VDR的表達進行了研究，發現它們均有VDR表達，主要定位于細胞質，而細胞核內無表達，提示維生素D可以不通過nVDR影響HCC的發生發展，表明維生素D對HCC可能存在非基因途徑，有待進一步研究證實。通過實時熒光定量 PCR檢測顯示，癌組織VDR mRNA水平明顯高于癌旁組織或正常肝臟組織，HCC組織VDR蛋白表達也強于癌旁組織或正常肝臟組織。根據HCC組織、癌旁組織和正常肝組織VDR mRNA及其VDR蛋白表達的差異，推測VDR與HCC的發生、發展存在密切聯系。然而，VDR升高是發生在腫瘤之前，還是腫瘤發生后導致VDR的升高，還需要進一步研究。

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