CIK細胞在原發性肝癌三維適形放療聯合TACE治療中的應用研究

李國濤，臧珂，殷榮坤

經動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是公認的治療不能手術切除的中晚期PLC患者的首選方法之一[1]，但由于血供豐富，TACE術通常不能使肝癌病灶完全壞死。隨著三維適形放療（three-dimensionalconformal radiation therapy，3D-CRT）技術的發展，放療在PLC治療中的應用日益增多。多項研究表明[2-4]，TACE聯合3D-CRT治療能延長患者生存期。但是，TACE與放療聯合治療毒副反應相應增加，損傷了患者的免疫功能，進而影響患者的生存質量[5]。1986年，德國學者Schmidt-Wolf采用多種細胞因子誘導外周血單個核細胞，分離出細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK），并應用于腫瘤患者的治療。CIK是以CD3+CD56+T細胞為主要效應細胞的一組異質性細胞群，具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性的抗腫瘤特性和 T淋巴細胞強大的抑瘤活性，能以非特異性免疫的方式根除患者體內微小的殘余腫瘤病灶，重建患者的免疫功能[6，7]。本研究采用TACE聯合放療治療PLC患者，再回輸CIK細胞治療，以探討其療效情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年1月～2016年1月我院就診的經影像學或病理學檢查證實的原發性肝癌患者51例，男40例，女11例；年齡35～75歲，平均年齡（58.3±3.5）歲。其中經超聲引導下穿刺活檢病理學檢查診斷為肝細胞癌（HCC）30例。入組患者肝內腫塊直徑為3～10 cm，無黃疸、腹水或遠處轉移，經綜合評價無手術切除指征，預計生存時間大于半年，心電圖及肝腎功能檢查指標基本正常，無放療或TACE治療禁忌證，KPS評分≥70分。患者及其家屬簽署知情同意書，本研究方案經醫院醫學倫理委員會批準同意。采用隨機數字表法將患者分為治療組26例和對照組25例，分別給予三維適形放療聯合TACE治療，然后給予CIK細胞回輸治療或僅行三維適形放療聯合TACE治療。兩組性別、年齡、KPS評分、腫瘤分級、腫瘤數目等一般資料經統計學比較，無顯著性差異（P＞0.05，表1），具有可比性。

1.2 TACE治療方法 先行肝動脈造影，以了解腫瘤的具體位置和大小等情況，并明確腫瘤的供血動脈。注入5-氟尿嘧啶 500～750 mg，卡鉑200～300 mg，絲裂霉素20 mg，并應用碘化油栓塞腫瘤血管。對合并有動靜脈瘺患者先行瘺口栓塞，再行碘油栓塞。每隔1月進行一次TACE術，每例共2次。

1.3 三維適形放療 應用電子直線加速器和立體定向放射治療計劃系統進行放療。先行模擬定位，行CT增強掃描，層厚5 mm，范圍為自病灶上下各8～10 cm，將CT圖像傳輸至三維治療計劃系統。大體腫瘤體積（gross tumor volume，GTV）包括原發性病灶。臨床靶體積（clinical target volume，CTV）為在GTV的基礎上向四周外擴1.0 cm。計劃靶體積（planning target volume，PTV）為在CTV的基礎上向上下外擴2 cm，向左右外擴1.5 cm。常規分割（2 Gy，5 次 /w），中位放療劑量為 50 Gy（42～76 Gy）。

表1 兩組一般資料[n（%）/（±s）]比較

表1 兩組一般資料[n（%）/（±s）]比較

治療組（n=26）對照組（n=25） x2/t P值性別 0.899 0.343男19（73.1） 21（84.0）女7（26.9） 4（16.0）年齡（歲） 57.6±2.9 59.9±4.3 17.433 0.154 KPS評分 0.692 0.708 70 3 2 80 6 4≥90 17 19 HbsAg陽性 24（96.0） 22（88.0） 0.267 0.605 AFP（μg/L） 528.6±146.8 511.4±146.3 14.232 0.098 Child-Pugh分級 1.199 0.274 A 級 22（84.6） 18（72.0）B 級 4（15.4） 7（28.0）腫瘤數目 0.339 0.560單發 19（73.1） 20（80.0）多發 7（26.9） 5（20.0）

1.4 CIK細胞培養與回輸方法 參照參考文獻[8，9]的方法培養CIK細胞。在TACE術和放療前，使用CS-3000血細胞分離機采集治療組患者外周血80 ml，用淋巴細胞分離液（上海試劑二廠）分離純化單個核細胞（PBMC），用AIMV無血清培養基（美國Sigma公司）調整細胞數為4×106/mL，置于37℃，5%CO2培養箱培養2 h。收集非貼壁細胞，移至新的培養瓶，計數并用RPMI-1640培養液調細胞數為1×106/mL。第1 d，加入重組人γ干擾素（rh-IFN-γ，R&D公司）1000 U/mL，置于37℃ 3000 ml培養袋（美國Invitrgen公司），在5%CO2條件下懸浮培養。24 h后，加入重組人白細胞介素2（rh-IL-2，R&D公司）1000 U/mL和抗CD3單克隆抗體（美國BD公司）100 ng/mL繼續培養48 h。每隔3 d，等量換液，并加入rh-IL-2繼續培養至21 d。在第21 d時，取細胞懸液1 ml，使用EPICSXL流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測CD3+CD56+和CD3+CD8+細胞（美國BD公司）比例。當CD3+CD56+細胞數≥50%，CD3+CD8+細胞≥30%，且細胞懸液細菌、真菌和內毒素檢測均為陰性時，將CIK細胞（5×109）用生理鹽水洗滌3次，并加入含1%人血白蛋白的生理鹽水250 ml中，經外周靜脈回輸，1次/d，連續5 d。

1.5 檢測與療效判定 使用EPICSXL流式細胞儀檢測外周血 T 細胞亞群（CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+比值）和NK細胞（CD16+CD56+）。按照Response E-valuation Criteria Solid Tumors（RECIST）標準[10]評定近期療效，分為完全緩解（complete remission，CR）：全部病灶消失，維持4周以上；部分緩解（partial remission，PR）：腫瘤縮小至少30%，維持4周以上；穩定（stable disease，SD）：介于 PR 和進展（progression，PD）之間；PD：病灶增加超過20%或出現新病灶。客觀有效率（RR）=CR+PR。依據Karnofsky評分變化評價患者的生活質量（QOL）：治療后KPS增加≥10分為QOL改善，治療后KPS變化＜10分為QOL穩定，治療后KPS減少≥10分為QOL降低。總生存期（overall survival，OS）的計算為自治療結束至患者死亡或末次隨訪日止。

1.6 統計學分析 計數資料以率表示，采用x2檢驗；計量資料以±s表示，采用配對t檢驗，應用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞變化比較 在接受CIK細胞治療后1月，治療組患者外周血CD3+、CD4+和CD16+CD56+占外周血單個核細胞百分比水平和CD4+/CD8+比值顯著高于，而CD8+顯著低于對照組（P＜0.05，表2）。

2.2 生活質量改變情況 在治療結束后，治療組生活質量評分改善率顯著高于對照組（P＜0.05，表3）。

2.3 兩組近期療效比較 治療組患者在接受放療/TACE/CIK聯合治療后肝臟腫瘤病灶明顯縮小（圖1、圖2）。在治療結束3個月，治療組客觀有效率明顯高于對照組（P＜0.05，表4）。

2.4 生存率比較 隨訪至2017年1月，治療組1 a生存率為73.1%（19/26），顯著高于對照組的52.1%（13/25，P＜0.05）。

表2 兩組外周血T細胞亞群和NK細胞比率（±s）比較

表2 兩組外周血T細胞亞群和NK細胞比率（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

例數CD3+（%）觀察組 治療前 26 51.25±1.14治療后 66.47±1.25①對照組 治療前 25 52.33±2.21治療后 53.17±0.98 CD4+（%）44.08±1.25 56.98±2.65①45.04±1.64 48.09±0.27 CD8+（%）43.17±1.47 37.56±1.26①43.20±2.19 42.67±4.35 CD4+/CD8+比值1.02±0.85 1.52±2.10①1.04±0.75 1.13±0.06 CD16+CD56+（%）16.18±1.23 22.45±6.41①17.26±4.54 19.74±1.88

表3 兩組治療后生活質量變化情況（%）比較

表4 兩組近期療效（%）比較

圖1 肝癌患者腹部CT表現 65歲男性PLC患者在接受放療和TACE治療后，CT顯示肝右葉腫瘤病灶碘油浸潤良好

圖2 肝癌患者腹部CT表現 圖1患者在接受CIK治療后，CT顯示肝右葉病灶明顯縮小

3 討論

近年來，隨著對免疫治療方法的不斷研究發現，過繼免疫已逐漸成為腫瘤的生物治療研究重點[11-14]。在繼淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）、腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）和CD3單克隆抗體激活的殺傷細胞（CD3AK）之后，CIK細胞以較高的增殖活性、更強的殺瘤活性和對骨髓或造血細胞無明顯毒副作用等優點，成為目前腫瘤過繼免疫治療的研究熱點[15，16]。CIK細胞是CD3+CD8+CTL和CD3+/CD56+為主的細胞群，具有T淋巴細胞強大的殺瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤活性，因此又被稱為NK細胞樣T 淋巴細胞[17-19]。

有研究[18]將85例已行TACE聯合射頻消融術治療，經影像學檢查顯示病灶無活性且無遠處轉移的PLC患者隨機選擇45例為研究組，接受CIK細胞經肝動脈回輸治療，其余40例為對照組不進行CIK細胞回輸治療。結果CIK細胞回輸后外周血CD3+、CD4+、CD56+（NK）效應細胞百分比和CD4+/CD8+比值顯著上升，CD8+和CD3+CD56+效應細胞百分比下降，研究組1年和18個月腫瘤復發率分別為8.9%和15.6%，而對照組為30.0%和40.0%（P＜0.05）。本研究觀察組患者T細胞亞群和NK細胞均得到改善，與上述研究結論一致。有人將146例無手術指征的PLC患者分為TACE聯合CIK組72例和單純TACE組74例，結果聯合組1 a和 a無進展生存率分別為40.4%和25.3%，顯著高于單純TACE組的7.7%和2.6%。兩組中位生存期分別為31個月（95%CI為27～35個月）和10個月（95%CI為7～13個月）。本研究治療組患者1 a生存率為73.1%，高于郝明志的研究結果，考慮可能與本研究采用了TACE聯合放療治療進一步提高了療效。

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