采后柑橘果實糖酸代謝研究進展

梁芳菲,王小容,鄧麗莉,曾凱芳,姚世響*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(西南大學 國家級食品科學與工程實驗教學示范中心，重慶，400715)

柑橘果實富含多種營養物質，如碳水化合物、維生素、抗氧化劑和礦質元素，深受消費者喜愛[1]。其中，糖酸是果實的核心食用品質，果實風味不僅取決于糖酸的含量，也取決于糖酸的種類和比例[2]。我國的柑橘品種主要在10月到12月之間成熟，采后貯藏是緩解集中上市造成的銷售困難以及保障柑橘周年供應的主要策略。糖酸風味變淡是柑橘采后貯藏的主要問題之一，嚴重制約果品的食用價值和商品價值，影響柑橘產業的可持續發展[3]。因此，采后柑橘糖酸代謝是近年來采后生物學領域的研究重點和熱點。本文綜述了采后柑橘果實中糖酸的組成、變化規律及其代謝途徑的最新研究進展，對推動采后柑橘果實糖酸代謝研究具有重要意義。

1 柑橘果實糖酸組成及在采后的變化規律

1.1 果實可溶性糖組分與含量及其在采后的變化規律

柑橘果實缺乏儲備型碳水化合物，而是以積累可溶性糖為主，果實成熟時糖含量為10%左右[4]。可溶性糖主要有蔗糖、葡萄糖和果糖3種，這3種組分的比例在不同柑橘種類中不同[5]。在寬皮柑橘中，椪柑果實成熟時，蔗糖、葡萄糖和果糖含量分別為39、16、9 mg/g，比例約為4.3∶1.8∶1[6]，溫州蜜柑成熟果實中蔗糖、葡萄糖和果糖含量比例約為5∶1∶1[7]。甜橙成熟時蔗糖、葡萄糖和果糖的比例約為1∶1∶1[8]，HB柚果實中也有類似的規律[9]。葡萄柚果實中，葡萄糖和果糖的含量相當，而蔗糖含量為葡萄糖的2～3倍[10]。

柑橘果實的可溶性糖主要來源于葉片的光合作用產物，果實采收之后失去母體的營養供給，仍是獨立的“生命個體”，需維持正常的呼吸作用，為各種生理生化反應提供能量。可溶性糖含量在果實采后初期輕微增加后呈總體下降趨勢[11]。寬皮柑橘中，溫州蜜柑在10℃貯藏時果肉葡萄糖和果糖含量呈先升高后降低的趨勢，貯藏90 d后葡萄糖和果糖含量分別下降了30.34%和18.83%[12]；椪柑果實在貯藏3個月后，可溶性糖含量下降了約30%[13]。“鮑威爾”臍橙在貯藏過程中蔗糖含量持續降低，葡萄糖和果糖含量則呈上升趨勢[14]。HB(Hirado Buntan)柚果實在貯藏4月后，可溶性糖含量從76 mg/g下降至49 mg/g，蔗糖、葡萄糖和果糖呈相似的下降趨勢[9]。

1.2 果實有機酸組分與含量及其在采后的變化規律

有機酸對柑橘果實的風味十分重要，含量過高或過低都會影響果實的正常風味。不同種類柑橘果實的有機酸含量差異較大，可分為低酸型(<0.8%)、中等酸型(0.8%～1.5%)、高酸型(>1.5%)[15]。柑橘有機酸主要有為檸檬酸、蘋果酸、烏頭酸、琥珀酸、延胡索酸等，其中檸檬酸占總有機酸含量的70%～90%，尤其在高酸和鮮食品種含量較高[15]。檸檬酸在果實生長發育過程中，由可溶性糖經三羧酸循環在線粒體合成后儲于液泡[16]。

與可溶性糖相比，柑橘果實有機酸在采后的下降趨勢更為劇烈。椪柑果實中檸檬酸占有機酸含量約90%，在采后3個月貯藏期內，下降約50%[13]。溫州蜜柑果實在不同溫度(5、10、20、30 ℃)貯藏14 d，有機酸含量呈顯著下降趨勢[17]。對柚類果實(HB柚、沙田柚和琯溪蜜柚)采后貯藏過程中的有機酸含量進行分析后發現：琯溪蜜柚檸檬酸含量呈上升趨勢，蘋果酸、烏頭酸和延胡索酸在采后呈下降趨勢；HB柚和沙田柚中4種有機酸含量呈整體下降趨勢[18]。采后枯水時，柑橘有機酸迅速消耗，檸檬酸含量在椪柑、臍橙和琯溪蜜柚分別下降為對照的39%、20%和50%[19-21]。

對于部分有機酸含量較高的柑橘品種，需要在采后對其進行降酸處理，以提高品質。熱處理是比較有效的方法，40 ℃熱空氣處理椪柑2 d后，在40 d的貯藏周期內，檸檬酸和總有機酸含量顯著低于對照果實[22]。

1.3 果實中糖酸分布規律

柑橘果實中糖酸含量的分布特征在學術界并沒有引起足夠的重視。研究發現伏令夏橙果實中可溶性固形物呈極性分布的特征，即濃度從果蒂處向果頂處逐漸升高[23-24]。本課題組研究發現椪柑果實中的可溶性固形物和有機酸含量具有類似的極性分布特征[19]。考慮到柑橘的一些采后生物學現象具有位置效應，如柑橘枯水常發端于果蒂處并向果頂處發展[19]、血橙從果實頂部開始合成花青素并逐漸向果蒂處延展等，果實中糖酸的極性分布可能具有重要的生物學意義。

2 采后柑橘果實糖代謝途徑

2.1 糖降解

柑橘果實糖代謝包括蔗糖合成代謝、蔗糖分解代謝和單糖降解代謝。蔗糖合成有2個重要步驟，蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖合成6-磷酸蔗糖，6-磷酸蔗糖由蔗糖磷酸酯酶(Sucrose phosphate phosphatase, SPP)水解生成蔗糖。采后柑橘果實的蔗糖代謝，其合成途徑受抑制而降解途徑被激活。催化蔗糖合成與降解的一個關鍵酶是蔗糖合酶(Sucrose synthase, SUS)，當尿苷二磷酸(Uridine diphosphate，UDP)存在時，蔗糖合酶可逆地催化蔗糖裂解為UDP-葡萄糖和果糖。轉化酶(Invertase, IN)是催化蔗糖降解的關鍵酶，根據亞細胞定位分為細胞壁轉化酶(Cell wall invertase, CWIN)、細胞質轉化酶(Cytoplasmic invertase, CIN)和液泡轉化酶(Vacuolar invertase, VIN)。轉化酶不可逆地催化蔗糖降解成葡萄糖和果糖，其中從質外體途徑進入的蔗糖被CWIN水解，從胞間連絲進入的蔗糖被CIN水解，儲存在液泡中的蔗糖被VIN水解[25]。

溫州蜜柑果實的SUS酶活性在發育早期較高，隨后下降，在成熟時期又急劇升高，SUS酶活與蔗糖積累有很強相關性，這表明SUS在柑橘果實蔗糖的合成代謝中起重要作用[26]。生物信息學分析和基因表達實驗的結果顯示柑橘基因組至少存在6個編碼SUS的基因[27]。在采后貯藏過程中，柑橘SUS的表達模式比較復雜，蛋白質組學揭示椪柑果實SUS的蛋白水平沒有顯著變化[13]，而在“鮑威爾”臍橙中，SUS的基因轉錄水平呈部分上升和部分下降的特征[14]，這暗示SUS可能不是柑橘果實采后蔗糖含量變化相關的主要酶。對椪柑果實采后枯水的研究發現，SUS的轉錄水平顯著下降，顯示SUS可能在柑橘枯水時蔗糖快速消耗過程中發揮重要作用[19]。椪柑果實在采后低溫貯藏過程中，有2個轉化酶編碼基因(Cit.29849.1.S1_at and Cit.29601.1.S1_s_at)表達量上調，其可能參與催化蔗糖降解為葡萄糖和果糖[28]。臍橙采后貯藏時CWIN和CIN基因普遍呈上調表達的特征，表明轉化酶在蔗糖降解為單糖過程中起重要作用[14]。椪柑采后枯水時轉化酶基因表達量顯著上調，可能與與蔗糖消耗密切相關[19]。

單糖降解途徑有果糖激酶(Fructokinase, FRK)和己糖激酶(Hexokinase, HXK)2個關鍵酶，分別催化果糖和葡萄糖生成6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖，然后進入糖酵解途徑和三羧酸循環，為細胞的生理生化反應提供能量。臍橙采后貯藏過程中，包括FRK、HXK和磷酸葡萄糖變位酶(Phosphoglucomutase，pgm)的基因表達普遍呈上調趨勢；另外糖酵解途徑相關酶，如6-磷酸果糖激酶(6-Phosphofructokinase 3，PFK3)、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(Fructose-bisphosphate aldolase，FBA)、烯醇化酶和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)等的編碼基因均呈現表達量上調趨勢；這些結果表明蔗糖降解為葡萄糖和果糖，然后進入糖酵解途徑被消耗是柑橘采后可溶性糖含量降低的重要機制[14]。運用轉錄組學和代謝組學技術對采后貯藏階段的椪柑、甜橙、檸檬和柚子進行系統研究后發現，大量糖降解途徑相關基因的表達量呈上調趨勢[11]。椪柑在采后枯水時，HXK基因表達量顯著上調[19]。

另外，糖降解途徑的中間產物還可作為細胞壁組分的合成前體。蔗糖的降解產物UDP-葡萄糖經UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGP)催化后進入纖維素合成途徑[29]。UDP-葡萄糖在生成UDP-葡萄糖醛酸后，由UDP-葡萄糖醛酸-差向異構酶(UDP-glucuronate 4-epimerase，GAE)和半乳糖醛酸轉移酶(Galacturonosyltransferase，GAUT)催化進入果膠合成途徑[30]。椪柑在采后枯水時，汁胞UGP、GAE和GAU6T基因的表達量均顯著上升，表明枯水時可溶性糖流向了細胞壁合成途徑[19]。另外糖酵解的產物也可進入細胞壁合成途徑，如磷酸烯醇式丙酮酸可通過莽草酸途徑合成苯丙氨酸，然后進入木質素合成途徑。椪柑枯水時，木質素合成途徑的關鍵酶-肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)基因表達量顯著上調[19]。

2.2 糖轉運

可溶性糖在不同細胞器、不同汁胞、不同組織(果肉和果皮)之間的轉運由蔗糖轉運子(Sucrose transporter, SUT)、單糖轉運子(Monosaccharide transporter, MST)、SWEET(Sugar will eventually be exported transporter)等蛋白家族完成[25, 31]。蔗糖轉運子是一類具有蔗糖轉運活性的蔗糖載體，廣泛存在于高等植物細胞和組織中介導蔗糖的跨膜運輸，生物信息學分析顯示柑橘基因組中有3個SUT基因[32]。SUT1基因在草莓中具有重要功能，沉默SUT1基因會降低果實蔗糖含量并延遲成熟[33]；“奉節72-1”和晚熟突變體“奉晚”臍橙成熟時SUT1基因表達均發生顯著變化，顯示SUT1基因可能在柑橘果實成熟時扮演重要功能[2]。蘋果中的最新研究發現，ABA響應轉錄因子MdAREB2通過激活SUT基因提高果實中蔗糖的含量，這種ABA調控蔗糖積累的機制可能在果實中普遍存在[34]。

單糖轉運子(MST)主要位于細胞膜和液泡膜上介導葡萄糖、果糖的運輸。生物信息學分析顯示甜橙基因組中有58個MST，可以分為7個亞家族[35]。甜橙MST基因啟動子區域存在可能被糖、激素和脅迫作用的順式作用元件，部分MST成員在果實成熟過程中表達量顯著上調[35]。糖轉運蛋白SWEET家族介導細胞內蔗糖的外排，對于蔗糖的韌皮部裝載十分重要[36]。甜橙基因組有16個SWEET基因家族成員，其中部分成員在果實成熟過程特異性地表達[35]。

部分柑橘種類在采后貯藏過程中，果皮有相對再生長的現象，因此需要從果肉轉運包括糖在內的營養物質至果皮[37-38]。程運江課題組運用轉錄組學和代謝組學技術對柑橘果實采后貯藏中糖酸組分變化及相關基因表達進行了系統研究，結果發現，柑橘在采后貯藏過程中，尤其是包括椪柑在內的寬皮柑橘，存在極為顯著的營養物質從果肉到果皮的轉運，從而維持果皮對逆境脅迫的適應能力[11]。

3 采后柑橘果實有機酸代謝

柑橘果實有機酸合成于果實生長發育階段，在成熟后期開始逐漸降解。檸檬酸在線粒體由檸檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)催化草酰乙酸和乙酰輔酶A生成。檸檬酸降主要有以下幾種途徑：作為底物參與三羧酸循環為細胞供能；γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)支路；合成谷氨酰胺以及其他氨基酸；合成次生代謝物以及芳香物質、植物激素和黃酮等[15, 22]。

3.1 三羧酸循環

檸檬酸作為三羧酸循環的底物，直接參與呼吸作用，為細胞的各種生理生化途徑提供能量，這是柑橘采后檸檬酸降解的重要途徑[4]。在三羧酸循環中，線粒體順烏頭酸酶(Aconitase, Aco)將檸檬酸異構化為異檸檬酸，然后由NAD型異檸檬酸脫氫酶(NAD-isocitrate dehydrogenase, NAD-IDH)催化脫氫生成α-酮戊二酸。分析檸檬果實成熟過程中Aco酶活性后發現線粒體Aco酶活的降低有利于成熟階段檸檬酸的積累，而細胞質Aco酶活的升高則有助于成熟后期檸檬酸含量的降低[39]。對多種柑橘果實(椪柑、甜橙、檸檬、柚類)采后衰老過程中的基因表達進行轉錄組學分析，結果表明三羧酸循環相關基因呈上調趨勢，這表明包括三羧酸在內的呼吸途徑是柑橘采后檸檬酸含量降低的重要原因[11]。對HB柚(Citrusgrandis)和Fairchild (Citrusreticulata)的40個雜交群體進行分析后，發現采后檸檬酸含量高的群體是由于線粒體Aco酶的活性較低，進而三羧酸循環活性被抑制所致[40]。琯溪蜜柚粒化汁胞中Aco活性顯著高于正常汁胞，并且基因表達也顯著升高，這是檸檬酸快速消耗的重要原因[21]。椪柑采后貯藏過程中，Aco和IDH基因在枯水汁胞中的表達量顯著低于正常汁胞，表明三羧酸循環在采后枯水時被激活，參與有機酸的消耗[19]。另外，血橙采前套袋處理可降低果實檸檬酸含量，提升果實品質，轉錄組結果顯示這可能與三羧酸循環活性升高，促進酸消耗有關[41]。

3.2 GABA支路與谷氨酰胺合成途徑

細胞質Aco將檸檬酸催化為異檸檬酸，再由NADP型異檸檬酸脫氫酶(NADP-isocitrate dehydrogenase, NADP-IDH)催化生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸有兩個去處：經谷氨酸脫羧酶催化生成GABA，進入GABA支路，或經谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)生成谷氨酸后由谷氨酰胺合酶(Glutamine synthase, GS)催化生成谷氨酰胺。GABA可轉運至線粒體，在GABA轉氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶催化生成琥珀酸，重新進入三羧酸循環[42]。GABA支路與谷氨酰胺合成途徑是柑橘果實檸檬酸降解的重要途徑。對柑橘汁胞和愈傷組織進行缺鐵處理，顯著抑制了細胞質順烏頭酸酶活性，并伴隨著檸檬酸在柑橘果實中的大量積累[43]。CHEN等[22]從椪柑中克隆了3個Aco編碼基因，發現CitAco3在檸檬酸降解過程中起主要作用，在柑橘果實中過表達可顯著降低檸檬酸含量[44]。

LIU等從柑橘中克隆了2個編碼谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)的基因CsGAD1和CsGAD2，在果實成熟過程中CsGAD1表達量是CsGAD2的2倍，并且CsGAD1表達量與谷氨酸脫羧酶活性呈正相關，與有機酸含量呈負相關；這表明柑橘CsGAD1基因在果實檸檬酸降解合成GABA途徑中起關鍵作用[45]。HB柚在長期貯藏中，GABA和谷氨酰胺含量均顯著上升，這暗示這些物質的合成可能是有機酸降解的去處[9, 18]。對HB柚(Citrusgrandis)和Fairchild(Citrusreticulata)的雜交群體分析發現，GABA支路的低活性導致柑橘果實中檸檬酸的高含量[40]。用GABA處理采后柑橘果實，可以顯著緩解檸檬酸含量的降低，保持果實品質，這進一步證明GABA支路是柑橘采后檸檬酸降解的重要流向[46]。對剛采收的椪柑用熱處理(40 ℃熱空氣，2 d)可有效降低果實檸檬酸含量，提高風味；在此過程中，細胞質Aco、IDH和GAD基因表達量均顯著升高，而糖酵解相關基因表達量并無顯著變化，表明GABA支路是熱處理降低果實檸檬酸的可能機制[22]。另外，椪柑采后貯藏過程中，枯水汁胞中的GABA支路與谷氨酰胺合成途徑的相關基因均被激活，暗示其參與了枯水汁胞中檸檬酸含量的降低[19]。盡管不同生境對柑橘果實的可溶性糖影響很小，但是對有機酸含量有顯著影響。對不同生境的臍橙(“紐荷爾”臍橙和“朋娜”臍橙)進行研究后，發現生境導致有機酸含量差異的機制可能與檸檬酸合成谷氨酰胺的活性，即檸檬酸在細胞質中通過Aco-IDH-GDH-GS相繼催化最終合成谷氨酰胺的活性有關[47]。

3.3 乙酰輔酶A合成途徑

在細胞質中，ATP-檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACL)可催化檸檬酸生成草酰乙酸和乙酰輔酶A。乙酰輔酶A參與合成異戊二烯和黃酮等次生代謝物。血橙在低溫(8 ℃)貯藏2～3個月時有機酸含量降低，同時花青素含量增加了約9倍[48]。另外低溫(6 ℃)貯藏2個月可顯著增加血橙中花青素、黃烷酮的含量[49]。血橙在采后低溫貯藏過程中，檸檬酸含量逐漸降低，ATP-檸檬酸裂解酶活性增強，檸檬酸降解的部分產物合成花青素，從而黃酮含量逐漸升高[50]。“鮑威爾”臍橙在采后衰老過程中，果實的ATP-檸檬酸裂解酶基因表達增強，異戊二烯和黃酮合成相關基因的表達有一定程度的上調表達[14]。椪柑枯水汁胞中，ATP-檸檬酸裂解酶基因表達也顯著增強[19]。

3.4 檸檬酸降解途徑相關轉錄因子

轉錄因子是調控基因轉錄的關鍵分子，對檸檬酸降解途徑轉錄因子的研究將有助于理解檸檬酸降解的分子機制，為調控柑橘檸檬酸代謝提供理論借鑒。LI等[51]從椪柑克隆了一個R2R3 MYB家族的轉錄因子CrMYB73，基因表達與果實檸檬酸積累呈正相關，在煙草中過表達該基因可以誘導檸檬酸的積累。這表明CrMYB73可能是一個調控檸檬酸合成的轉錄因子[51]。Aco是檸檬酸降解途徑的關鍵酶，其中CitAco3是關鍵基因，LI等發現轉錄因子CitNAC62和CitWRKY1協同作用，共同激活CitAco3的轉錄[52]。液泡型H+轉運ATP酶(V-ATPase)在有機酸轉運至液泡積累的過程中起重要作用[15]。LI等篩選了5個可能對檸檬酸積累起重要作用的V-ATPase基因，酵母雙雜交和雙分子熒光互補結果表明CitVHA-c4與轉錄組因子CitERF13可以相互作用。在擬南芥中同時過表達CitVHA-c4與CitERF13能夠提高檸檬酸含量，但在VHA突變體中過表達CitERF13則不能提高檸檬酸含量，這意味著CitERF13調控檸檬酸含量必須依賴于VHA[44]。

4 展望

糖酸是柑橘果實的核心食用品質，一直是學術界研究的重點和熱點。現有研究揭示了柑橘果實糖酸組分及含量在采后的變化規律、采后可溶性糖的降解機制、采后檸檬酸降解的主要途徑等。筆者認為采后柑橘糖酸代謝的研究還存在以下不足，可作為未來的研究重點：(1)盡管柑橘采后貯藏過程中的糖酸代謝途徑較為清楚，但對于柑橘采后枯水時糖酸迅速耗竭的分子機制還不清楚；(2)目前已知的柑橘采后有機酸降解途徑的關鍵轉錄因子還比較少；(3)協同調控糖酸降解與其他代謝物合成的分子機制是什么，參與調控該過程的轉錄因子有哪些？