產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥性與TEM型耐藥基因的關(guān)系探討

涂胡柳，黃永茂，林 雁，羅永鴻，孫長峰，趙東霞，鄒永勝，鐘 利，陳 莊

大腸埃希菌是目前臨床最為常見的病原菌，臨床分離率居革蘭氏陰性菌首位[1]，隨著抗菌藥物的廣泛使用，該病原菌的耐藥率也逐年升高，越來越多的臨床致病菌株表現(xiàn)為多重耐藥性，給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。產(chǎn)ESBLs是大腸埃希菌耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要機(jī)制，近年來TEM型ESBLs在我國的報(bào)道越來越多，本實(shí)驗(yàn)的目的是對我院大腸埃希菌臨床分離株的耐藥性、耐藥模式、TEM基因的檢出進(jìn)行分析，了解本院大腸埃希菌的耐藥變遷及TEM型ESBLs流行情況，從而指導(dǎo)臨床用藥，報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 來自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2014年7月-2014年11月臨床科室住院患者體液標(biāo)本共93株，為非同一患者重復(fù)菌株，其中痰液12株，尿液26株，血液17株，胸腹水5株，分泌物33株，所有實(shí)驗(yàn)菌株均經(jīng)過VITEK系統(tǒng)(BioMerieux，法國)進(jìn)行菌種鑒定確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2主要試劑及儀器 質(zhì)粒小提取試劑盒、藥敏紙片、電泳瓊脂糖、50×TAE緩沖液、DNA MarkerⅢ、GoldviewⅠ型核酸染色劑、雙蒸水、2×Taq PCR MasterMix、Bio-Rad自動(dòng)成像系統(tǒng)、Bio-RadPCR儀器等。

1.2方 法

1.2.1藥敏實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)ESBLs菌株的檢測 采用K-B法按照CLSI2012標(biāo)準(zhǔn)，對93株大腸埃希菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)耐藥性，雙紙片法確證ESBLs表型。

1.2.2臨床分離株質(zhì)粒DNA提取及TEM基因擴(kuò)增 按照質(zhì)粒小試劑提取盒提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA的步驟進(jìn)行，引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成，如表1。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10μl DNA模板、12.5μl 2×MasterMix、上下游TEM基因公共引物各1μl，加ddH2O至25μl。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5min，經(jīng)過32個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94℃變性30sec， 55℃復(fù)性30sec，72℃延伸30sec)，然后72℃延伸10min，1%瓊脂糖凝膠電泳法分析。

將PCR擴(kuò)增出的攜帶TEM基因的菌株進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，引物見表1，PCR反應(yīng)體系為50μl，包括10μ l DNA模板、上下游TEM基因特異性引物各2μl、25μl 2×MasterMix，加ddH2O至50μl。PCR擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5min，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95℃變性30sec， 57℃復(fù)性30sec，72℃延伸80sec)，然后72℃延伸10min，獲得的PCR產(chǎn)物采取上述相同的方法分析，將PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，通過MEGA7.0(http://www.megasoftware.net/)、BioEdit(http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/BioEdit.shtml)軟件比對分析確定基因型。

表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物

表2 93株大腸埃希菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2結(jié) 果

2.1藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 93株臨床分離株分別來源于痰液12株、尿液26株、血液17株、胸腹水5株，分泌物33株，分別占分離株的12.9%、27.96%、18.28%、5.38%和35.48%。總實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示大腸埃希菌對青霉素類、第二代頭孢菌素、部分三代頭孢菌素、氨基糖苷類、喹諾酮類、耐藥率菌較高，但對β-內(nèi)酰胺酶類/酶抑制劑復(fù)方制劑耐藥率較低，對頭霉素類、阿米卡星耐藥率低，對亞胺培南、莫西沙星敏感。不同來源標(biāo)本的具體耐藥數(shù)據(jù)見表2。

臨床分離株共檢出全敏菌株4株、單耐菌株5株、雙耐菌株18株、多耐菌株66株，分別占分離株的4.3%、5.38%、19.35%和70.97%，未檢出全耐菌株，耐藥模式以多重耐藥為主，其次為雙耐、單耐、全敏。

2.2ESBLs表型檢測結(jié)果 93株大腸埃希菌共檢出ESBLs陽性菌株55株，檢出率為59.14%，主要來源于分泌物38.18%和尿液29.09%；ESBLs陰性菌株38株，檢出率為40.86%，主要來源于血液31.58%、分泌物31.58%和尿液26.32%。具體數(shù)據(jù)見表3。

55株ESBLs陽性大腸埃希菌菌株中檢出雙耐藥菌株2株，檢出率為3.64%；檢出多耐藥菌株53株，檢出率為96.36%；未檢出全敏及單耐菌株。38株ESBLs陰性大腸埃希菌菌株中檢出全敏菌株4株、單耐藥菌株5株、雙耐藥菌株16株、多耐藥菌株13株，分別占ESBLs陰性菌株的10.53%、13.16%、42.11%和34.21%。具體數(shù)據(jù)見表4。

本實(shí)驗(yàn)檢出的66株多重耐藥大腸埃希菌菌株，ESBLs陽性者53株，其中30株多重耐藥菌株攜帶TEM基因，占TEM陽性基因的比例高達(dá)93.75%(30/32)；23株多重耐藥菌株未攜帶TEM基因。具體數(shù)據(jù)見表5。

表3 ESBLs表型檢測結(jié)果

2.3PCR檢測及序列分析結(jié)果 對臨床分離的55株ESBLs陽性大腸埃希菌菌株進(jìn)行TEM基因PCR擴(kuò)增，電泳圖見圖1，陽性菌株32株，陽性率為58.2%，經(jīng)過特異性TEM基因PCR擴(kuò)增后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。通過EGA7.0和BioEdit軟件比對分析，表明本地區(qū)只檢出TEM-1型一種基因型，未檢出其他亞型。

表4 ESBLs表型耐藥模式結(jié)果

圖5：TEM基因電泳結(jié)果圖

耐藥模式TEM陽性(32株)TEM陰性(23株)n%n%全敏菌株0000單耐菌株0000雙耐菌株26.2500多耐菌株3093.7523100

3討 論

本次實(shí)驗(yàn)93株臨床分離的大腸埃希菌株主要來自分泌物標(biāo)本，分離率為35.48%，其次為尿液和痰液標(biāo)本，分離率分別為27.96%和12.9%，這與胡付品[1]報(bào)道的標(biāo)本分布有所不同，這可能與本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量少、臨床使用抗菌藥物的種類、劑量、頻率、聯(lián)用情況等因素有關(guān)。耐藥數(shù)據(jù)表明大腸埃希菌對哌拉西林、第二代頭孢菌素、頭孢噻肟、大部分氨基糖苷類的耐藥率高(46.24%-78.49%)，對酶抑制劑、阿米卡星耐藥率低(1.08%-4.3%)，耐藥特點(diǎn)與2005-2014年CHINT大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果[2]一致。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明β-內(nèi)酰胺酶類/酶抑制劑復(fù)方制劑、頭霉素類、阿米卡星、莫西沙星、碳青霉烯類抗菌藥物均可作為首選藥物，但仍需嚴(yán)格掌握指征，根據(jù)藥敏結(jié)果選用，并注意其毒副作用。碳青霉烯類雖然是敏感性最高的抗菌藥物，但截至目前已有耐碳青霉烯類大腸埃希菌的報(bào)道[3]。對于第三代頭孢菌素的使用，尤其應(yīng)注意該菌株的ESBLs表型，以免造成耐藥基因的水平傳播而引起耐藥率升高。

本實(shí)驗(yàn)共分離ESBLs陽性菌株55株，分離率為59.14%，以分泌物及尿液標(biāo)本為主，主要分布于普外科、泌尿外科、婦產(chǎn)科。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率顯著高于ESBLs陰性菌株，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，說明ESBLs是導(dǎo)致大腸埃希菌產(chǎn)生多重耐藥的重要因素。TEM型ESBLs是一類經(jīng)質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、β-內(nèi)酰胺類抗生素，但能夠被β-內(nèi)酰胺酶類/酶抑制劑復(fù)方制劑所抑制。在我國的流行也是呈逐年上升的趨勢，我國流行的TEM型主要是TEM-1型[4]，雖然TEM-2型[5]、TEM-166型[6]等亞型在我國也有過相關(guān)報(bào)道，但均為散發(fā)，未見流行報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)顯示在產(chǎn)ESBLs菌株中，經(jīng)PCR篩選出32株TEM基因陽性菌株，檢出率為58.2%，與大多數(shù)國內(nèi)報(bào)道的處于同等水平[7] [8]，TEM基因分型只發(fā)現(xiàn)一種亞型，即TEM-1型，暫未發(fā)現(xiàn)其他亞型，提示本地區(qū)流行的TEM型ESBLs為TEM-1型，這與廖經(jīng)忠[9]報(bào)道的一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多重耐藥菌株66株，分離率70.97%，這明顯高于本地區(qū)2012年(33.80%)[10]、2013年(42.86%)[11]的多重耐藥菌株檢出率；66株多重耐藥菌株中ESBLs陽性菌株53株；ESBLs陰性菌株13株；雙耐藥菌株18株，其中ESBLs陰性菌株16株，ESBLs陽性菌株2株；單耐藥及全敏菌株9株，均為ESBLs陰性菌株；檢出ESBLs陽性同時(shí)攜帶TEM基因32株，32株中表現(xiàn)為多重耐藥性的有30株，2株表現(xiàn)為雙重耐藥；ESBLs陽性但TEM基因陰性的23株大腸埃希菌菌株全部表現(xiàn)為多重耐藥性，這可能是多重耐藥菌株還攜帶其他的ESBLs類型[12]如SHV型、CTX-M型、OXA型等有關(guān)。由此可見，ESBLs陽性菌株更容易產(chǎn)生多重耐藥性，這高于CHINET2005-2014年中國大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測[2]結(jié)果，這可能與濫用抗菌藥物有關(guān)，需注意ESBLs陰性菌株也以雙耐及多耐為主，除本實(shí)驗(yàn)樣本量偏小以外，是否存在其他的耐藥基因?qū)е麓竽c埃希菌的耐藥譜增寬還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。治療多重耐藥菌株應(yīng)嚴(yán)格遵藥敏結(jié)果，以免導(dǎo)致全耐藥菌株的產(chǎn)生。

綜上所述，本地區(qū)的大腸埃希菌耐藥率較高，多重耐藥菌株的逐漸增多是對臨床治療的巨大挑戰(zhàn)，大腸埃希菌的耐藥性與產(chǎn)ESBLs關(guān)系密切[13] [14]，尤其是多重耐藥的特征更是與ESBLs有密切的關(guān)系。ESBLs有五種類型，同時(shí)攜帶其他ESBLs類型耐藥基因可能是導(dǎo)致產(chǎn)生多重耐藥性的關(guān)鍵因素，故動(dòng)態(tài)監(jiān)測本院大腸埃希菌的耐藥率、耐藥性的變遷及進(jìn)一步研究本院大腸埃希菌的ESBLs其他類型是很有必要的，了解本院的大腸埃希菌耐藥率及流行的耐藥基因類型對指導(dǎo)臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義。

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