子宮內膜息肉干細胞的提取及內皮抑素對其血管生成的影響

田 金，張冬麗，姚 麗，宋璟景

子宮內膜息肉 (endometrial polyps, EP) 是一種可致子宮異常出血、不孕，甚至內膜惡變的常見婦科疾病。EP可發生于青春期后的女性，總體發病率高達25%。近年來，隨著婦科宮腔鏡檢查的推廣和輔助生殖技術的發展，EP的檢出率正逐年上升。目前，其發病機制尚不明確。研究[1]顯示，EP的發生可能與局部新生血管形成異常活躍有關。血管內皮生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)是EP發生發展過程中重要的血管生成因子，EP患者的VEGF表達水平在子宮內膜息肉中較正常內膜組織顯著增高[1]。因此推測VEGF能夠促進局部子宮內膜組織內新生血管的過度增殖，引起局部子宮內膜增生，最終形成子宮內膜息肉。內皮抑素是目前已知效果最好的內源性抗血管生成因子，能夠特異性抑制新生血管形成。目前已經應用于臨床腫瘤治療中，能夠有效地抑制血管生成和腫瘤生長[2]。其對子宮內膜異位癥的治療作用也有相關的實驗研究[3]。但是，應用內皮抑素治療子宮內膜息肉尚未見報道。因此，該研究通過觀察EP組織內VEGF的表達情況，繼而從EP中分離提取出干細胞并進行相關鑒定，采用體外培養法，檢測不同濃度的內皮抑素對子宮內膜息肉干細胞VEGF分泌水平的影響，探討血管內皮抑素對EP的治療作用。

1 材料與方法

1.1資料來源選取鄭州人民醫院2015年1月～6月因EP行宮腔鏡下內膜息肉切除術的患者，收集息肉組織，病理報告均為良性息肉樣增生，增殖期子宮內膜。同時選取息肉附近內膜組織用于提取子宮內膜干細胞。所有患者(年齡32～49歲，n=9)術前至少三個月未進行激素替代治療。對照組選取因輸卵管性不孕行診斷性刮宮的患者(年齡28～41歲)(n=9)的正常子宮內膜，排除其他任何子宮病變者。本研究取得了鄭州人民醫院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本處理 無菌獲取標本后，部分組織10%中性福爾馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋；部分組織置于DMEM/F-12 1 ∶1培養基中4 ℃保存，6 h內送至實驗室處理。

1.2.2免疫組化染色SP法測定VEGF蛋白表達 VEGF兔抗人多克隆抗體及SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司，一抗工作濃度為1 ∶200。按說明書操作，光鏡下觀察并采集圖像。結果判定：Image Pro Plus 6.0進行積分光密度測量分析，每張圖片隨機選擇5個高倍鏡視野(10×20)，以陽性區平均積分光密度值(IOD) 為測定值。

1.2.3子宮內膜息肉干細胞(endometrial polyps stem cells, EPMSCs)和子宮內膜干細胞(endometrial stem cells, EMSCs)的提取 將息肉組織和息肉附近子宮內膜轉移至培養皿中，無菌PBS沖洗以去掉血液和黏液，剪碎至糊狀，加入III型膠原酶(300 μg/ml)和DNA酶I(40 μg/ml)，37 ℃孵育1 h，每15 min震蕩1次。使用70 μm孔徑的細胞濾器過濾去除腺上皮細胞。收集濾液，800 r/min離心10 min，棄上清液。含有10%胎牛血清(FBS)和1%青/鏈霉素雙抗的DMEM/F-12 1 ∶1培養基(完全培養基)重懸細胞沉淀。將上述細胞懸液轉移至25 ml培養瓶中，37 ℃、5% CO2孵育，24 h后更換新鮮培養基去除未貼壁細胞。同法提取正常子宮內膜干細胞。每2～3 d更換培養基。待細胞生長至90%融合時，按1 ∶2比例傳代，標記為第一代(P1)，選取生長良好的P3～P5細胞用于后續實驗。

1.2.4逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR) 對細胞進行干細胞相關基因OCT-4鑒定(兩組n=5)。收集細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，應用一步法RT-PCR試劑盒，反應條件如下：42 ℃、1 h，94 ℃、15 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30s，72 ℃、30 s，35個循環；72 ℃、10 min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。紫外線下觀察記錄，以GAPDH為內參。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5細胞克隆形成實驗 選取3～5代生長情況良好的EPMSCs和EMSCs，以250個細胞/cm2接種于60 mm培養皿中。每組細胞分別接種3個培養皿。37 ℃、5% CO2培養箱培養，每天觀察細胞集落形成情況，每3 d換液1次。在培養的第14天，出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養，倒置顯微鏡下計數細胞個數>100的克隆數。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.6細胞生長曲線和群體倍增時間(population doubling time, PDT) 收集3～5代生長情況良好的EPMSCs和EMSCs，細胞計數板計數，以5 000個細胞/孔的密度接種于24孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h至細胞貼壁。從第2天起，每天收集并計數3個復孔中的細胞數目，取平均值，連續計數10 d，繪制細胞生長曲線。群體倍增時間根據公式：DT=[lg2/(lgNt-lgN0)]×t (h)計算(Nt=最終細胞數目；N0=初始細胞數目；t=培養時間)。

1.2.7流式細胞術 對細胞進行干細胞表面抗原鑒定。收集細胞，PBS洗滌2次，制成細胞濃度為2×104個/20 μl的單細胞懸液，分別加入抗體：鼠抗人CD34、CD45、CD73、CD90、HLA-ABC、HLA-DR，室溫避光孵育20 min，PBS洗2次，800 r/min離心5 min，300 μl PBS重懸，流式細胞儀檢測。

1.2.8多向分化鑒定 收集生長良好的細胞，分別轉移到成骨和成脂肪誘導培養基中，每3 d換液，完全培養基作對照。分別于3周和2周后進行茜素紅和油紅O染色，倒置顯微鏡進行觀察鑒定。

1.2.9酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 檢測EPMSCs(n=5)與EMSCs(n=5)VEGF的分泌情況。生長狀態良好的細胞棄去培養液，PBS洗滌2次，消化離心，完全培養基重懸。 將各組細胞分別以1×105個/孔接種于6孔板中，3個復孔。37 ℃、5% CO2孵育，分別于24、48、72 h后，收集細胞上清液，2 000 r/min離心20 min。采用人VEGF ELISA檢測試劑盒，按說明書操作，檢測每孔細胞培養上清液中VEGF的表達水平。完全培養基做陰性對照，PBS做空白對照。

1.2.10內皮抑素對EPMSCs和EMSCs血管生成的作用 收集生長良好的EPMSCs和EMSCs(n=5)，如上述方法接種于6孔板中，設置4個復孔，分別加入內皮抑素0、0.5、1、2 mg，37 ℃、5% CO2孵育48 h后收集細胞上清液，2 000 r/min離心20 min。采用ELISA法同法檢測每孔細胞培養上清液中VEGF的表達水平。完全培養基做陰性對照，PBS做空白對照。

2 結果

2.1EP組織中VEGF的表達VEGF蛋白主要分布于子宮內膜腺上皮細胞、血管內皮細胞、間質細胞及平滑肌細胞的胞質中。EP組織中VEGF陽性表達廣泛分布。EP組織VEGF表達(0.029 6±0.002 6)較正常增殖期內膜表達(0.023 4±0.002 0)增強(t=6.903，P<0.001)。見圖1。

2.2EPMSCs及EMSCs的分離、培養和鑒定為獲取子宮內膜息肉來源的子宮內膜干細胞，分離提取了9名來自子宮內膜息肉患者的EPMSCs，其中7例獲得成功。同樣，成功培養了8例EMSCs。EPMSCs及EMSCs均表現出貼壁生長的特點，光鏡下細胞呈梭型，旋渦狀排列，生長迅速，見圖2。兩種細胞均表達干細胞相關基因OCT-4，見圖2。流式細胞術結果表明：超過90%的EPMSCs和EMSCs表達MSC特有的標志物CD73和CD90。相反，不表達已知的造血干細胞標志物CD34和CD45。MHC I類分子HLA-ABC陽性表達，MHC II類分子HLA-DR陰性表達，見圖3、4。

圖1 子宮內膜息肉和正常子宮內膜中VEGF的表達 SP×200

A：VEGF在子宮內膜息肉中的表達；B：VEGF在正常子宮內膜中的表達

2.3EPMSCs及EMSCs的增殖能力在細胞克隆形成實驗中，EPMSCs及EMSCs在培養的第24 h基本全部貼壁。細胞大多呈梭形，外形輪廓尚清晰。單個細胞生長較為緩慢，培養第6天左右較大克隆增長迅速，較小克隆生長緩慢。在14 d中止培養，可見有含數百個細胞組成的克隆存在。EPMSCs的克隆形成率與EMSCs的克隆形成率比較，差異有統計學意義(t=3.199，P=0.033)，見圖5A。兩組細胞生長曲線大致呈現“S”型，接種后2 d內，細胞增長相對緩慢，從3 d起進入對數生長期，7 d起進入平臺期，細胞數目不再增加，見圖5B。由此計算出EPMSCs和EMSCs的PDT，二者之間差異有統計學意義(t=-6.594，P=0.003)，見圖5C。

2.4EPMSCs和EMSCs體外分化能力的鑒定為了進一步鑒定EPMSCs和EMSCs在體外是否能夠多向分化，本實驗研究了其分化成成骨細胞和脂肪樣細胞的潛能。在成骨誘導培養基中培養3周后，EPMSCs沿著細胞膜形成了紅色茜素基質，同時出現大紅色的骨質顆粒嵌入到細胞外基質，標志著成骨細胞化。在成脂肪誘導培養基中培養3周后，油紅O染色證明EPMSCs分化時在胞質內有脂滴形成。見圖6。

圖2 子宮內膜息肉及正常子宮內膜干細胞形態學和OCT-4鑒定

圖3 子宮內膜息肉干細胞表面標志物檢測A：CD-73；B：CD-90；C：HLA-ABC；D：CD-34；E：CD-45；F：HLA-DR

圖4 子宮內膜干細胞表面標志物檢測結果A：CD-73；B：CD-90；C：HLA-ABC；D：CD-34；E：CD-45；F：HLA-DR

圖5 EPMSCs和EMSCs增殖能力

2.5EPMSCs與EMSCs細胞培養上清液中VEGF的水平為了在細胞水平進一步證實EPMSCs與EMSCs在血管生成能力方面是否具有差異，本實驗應用ELISA法檢測了細胞培養上清液中VEGF的表達水平。48 h和72 h兩組細胞VEGF的表達量差異均有統計學意義(t=14.989，P<0.001；t=14.795，P<0.001)。24 hVEGF表達量差異無統計學意義(t=1.767，P=0.152)。見圖7。

2.6內皮抑素對EPMSCs和EMSCs血管生成的抑制作用為了探究內皮抑素對EP是否具有潛在治療作用，及其是否會對正常細胞產生不良影響，分別檢測了其對EPMSCs和EMSCs細胞培養上清液中VEGF的表達水平的影響。在依次加入0、0.5、1、2 mg的內皮抑素培養48 h后，EPMSCs細胞上清液中VEGF的含量。與非處理組相比，1、2 mg組均表現出對VEGF表達的抑制作用(F=68.423，P<0.001)。而0.5 mg組與非處理組之間的差異無統計學意義(F=68.423，P=0.095)，見圖8A。而在依次加入0、0.5、1、2 mg內皮抑素培養48 h后，與非處理組相比，加入2 mg內皮抑素后，EMSCs培養上清液中的VEGF分泌量明顯降低(F=8.384，P=0.011)。而0.5、1.0 mg組與非處理組之間的差異無統計學意義(F=8.384，P>0.05)，見圖8B。

圖6 子宮內膜息肉和子宮內膜干細胞體外分化茜素紅/油紅O×200

圖7 子宮內膜息肉和子宮內膜干細胞細胞培養上清液中VEGF的表達與EMSCs比較：***P<0.001

3 討論

3.1子宮內膜息肉組織中VEGF表達增高EP可以發生于任何年齡且發病率有增高趨勢，其發病機制不清，缺乏針對性治療方案，復發率較高。研究[4]顯示，EP與局部內膜增生和凋亡的失衡、激素失衡和藥物應用有關。臨床病理診斷EP的唯一標準是出現伴有厚壁血管的纖維組織，因此新生血管的形成可能與EP發生的關系密切。

圖8 內皮抑素對EPMSCs和EMSCs VEGF分泌的作用

A：內皮抑素對EPMSCs VEGF分泌的作用；B：內皮抑素對EMSCs VEGF分泌的作用；與0 ng/ml比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

VEGF是一種最有效的促血管生長因子，具有促進內皮細胞增殖和遷移的作用，能增加血管的通透性，使血液中大分子物質進入到細胞外基質中，有利于新生血管的形成。它不但與正常月經周期中子宮內膜的血管生成有關，而且也能夠參與以過度血管生成為特點的疾病的發生發展[5-6]。本實驗中EP組織VEGF表達較正常內膜明顯增強，提示VEGF可能在EP形成過程中發揮作用。在EP發生發展過程中，高表達的VEGF能夠誘發內皮細胞增殖和遷移，促進大量新生血管的形成。因此，可以推測子宮內膜中VEGF的過表達引起組織內新生血管的過度增生，最終造成了局部內膜增生形成息肉。

3.2子宮內膜息肉干細胞中VEGF表達增高據報道，子宮內膜息肉中VEGF表達顯著高于正常內膜，且僅發生于增殖期，表明其發生不只是條件致病，其自身子宮內膜的生物學行為與正常子宮內膜有著本質的不同[7]。因此猜測這種差異可能存在于細胞水平。最新研究[8-10]顯示，人體多種組織中能夠提取出原代成纖維樣細胞群，如：間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。為了證實這一結論，本研究團隊分離提取了EPMSCs和EMSCs，并對其進行了生物學特性的鑒定。實驗所分離提取的細胞能夠表達干細胞相關性基因OCT-4，這種特點與其他研究中報道的骨髓間充質干細胞和羊水間充質干細胞等MSCs相似[11]。本課題組進一步鑒定了EPMSCs和EMSCs的表面標志物，結果表明其高表達MSCs表面標志物，不表達造血干細胞表面標志物，MHC I類分子HLA-ABC低表達，不表達MHI II類分子HLA-DR，這說明本研究所提取的EPMSCs和EMSCs具備MSCs的表面抗原特性，且具有低免疫源性，可能成為一種新的MSCs組織來源，使其在細胞治療領域具備發展潛力。同時，體外多向誘導分化實驗也證實了EPMSCs和EMSCs具有了MSCs最重要的特征。EPMSCs和EMSCs在形態學、干細胞相關基因OCT-4表達、細胞表面抗原和體外誘導分化能力方面未見明顯差異。但EPMSCs與EMSCs相比，具有更強的增殖能力。EP組織中能夠分離提取出具備MSCs特性的EPMSCs，其多方面特點與已知的MSCs相似[10]。

EP與正常內膜中VEGF的表達在組織水平具有顯著差異，那么其在細胞水平是否具有差異呢？鑒于EP的發病的血管新生機制，局部內膜微環境中VEGF的分泌可能與這一機制密切相關。本研究檢測了EPMSCs與EMSCs細胞培養上清液中VEGF的水平，結果顯示，細胞接種后24 h內，兩組細胞VEGF的表達無明顯差異。但從24 h后開始至72 h，EPMSCs所分泌的VEGF顯著且持續增多，表達量高于EMSCs。這說明EP細胞具有更強的血管生成能力，這不僅證實了筆者之前關于子宮內膜息肉和正常子宮內膜之間差異的猜測，而且為子宮內膜息肉的治療提供了新的想法。

3.3內皮抑素能夠抑制子宮內膜干細胞血管生成作用為了證實這一想法，筆者應用內皮抑素作用于EPMSCs，以驗證其對EP可能產生的治療作用。內皮抑素是已知的實驗效果最好的血管生成抑制劑，值得一提的是，其能夠特異性抑制新生血管的形成，而對成熟血管幾乎沒有作用。本實驗表明結果，在經過不同濃度的內皮抑素處理后，EPMSCs的VEGF表達水平確實有不同程度的降低，這說明內皮抑素能夠抑制EPMSCs VEGF的表達，進而抑制EP的血管生成和病灶生長。但是，作為一種不斷再生的組織，正常子宮內膜也可能會受到內皮抑素的影響。因此，本研究應用同樣時間劑量的內皮抑素作用于EMSCs，結果表明其分泌的VEGF同樣能夠被內皮抑素所抑制。由于EMSCs 48 h所分泌的VEGF顯著少于EPMSCs，其受內皮抑素的抑制效果不如EPMSCs明顯，但這并不能表明正常子宮內膜的再生不會受到內皮抑素的不良影響。因此，應用內皮抑素治療EP的有效和安全時間劑量或給藥方式仍需要進一步探索。

綜上所述，EP中VEGF的表達在組織水平和細胞水平均高于正常內膜。此外，內皮抑素能夠在細胞水平對EP產生抑制作用，這填補了關于內皮抑素用于治療EP的基礎研究的空白。另外，EP組織中能夠提取出MSCs，有可能成為一種可選的成體干細胞組織來源。

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