AML對柔紅霉素的耐藥性與TET2基因突變的相關性

楊 柳，葛 健，夏瑞祥

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML) 是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，具有高度異質性，以骨髓原始細胞的異常增殖和分化為特征，化療是其最主要的治療手段之一，但因原發或繼發耐藥的原因而導致治療失敗率居高不下。目前有研究[1]表明，表觀遺傳學異常，如DNA甲基化可影響白血病細胞對化療藥物的敏感性。研究[2-3]顯示TET2基因突變與造血系統惡性腫瘤密切相關，并在診斷、治療和預后評估中具有潛在價值。Viguié et al[4]在4例AML患者中發現4q24上的基因重排，通過BAC克隆和熒光原位雜交顯示4q24斷裂處0.5Mb的缺失區域。Delhommeau et al[5]首次報道了在骨髓增殖性疾病患者中染色體4q24的雜合缺失，TET2基因突變最早發現于JAK2V617F陽性的骨髓增殖性疾病中，后來在系統性肥大細胞癥，骨髓增生異常綜合癥及AML中也有發現。該研究利用高通量二代測序及體外藥敏試驗等技術手段，將54種白血病相關基因與AML對于化療藥物耐藥性之間的相關性進行探討，同時將其與臨床資料結合，以期找出具有預測發生耐藥的特定指標。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年1月～12月安徽醫科大學第一附屬醫院血液科初診AML患者74例，其中男40例，女34例，年齡16～83歲，中位年齡46歲。根據2008年WHO診斷標準將患者分為：AML微分化型(M0)1例，AML未分化型(M1)2例，AML部分分化型(M2)41例，急性粒單細胞白血病(M4)11例，急性單核細胞白血病(M5)16例，急性紅白血病(M6)3例。 基因檢測時間：初診治療前。高通量體外藥敏檢測試驗抽樣時間：患者接受治療前抽取外周靜脈血4～8 ml。

1.2單個核細胞分離純化患者所取樣本采用Ficoll密度梯度離心法分離，同時淋巴細胞分離液和細胞培養液RPMI 1640預熱至室溫。在15 ml離心管中加入適量的淋巴細胞分離液，取肝素抗凝靜脈血與2倍量的Hank’s液或RPMI 1640充分混勻，離心。離心后取中間白色云霧層狹窄帶單個核細胞層，加入含有20%胎牛血清的RPMI 1640，重懸細胞。

1.3高通量二代測序實驗方法分離提純的單個核細胞進行DNA抽提，NanoDrop鑒定純度。DNA與探針混合后先加溫到95 ℃ 1 min，然后將熱模塊設到40 ℃讓樣本探針緩慢降溫到40 ℃(大概需要約80 min)。然后，除未雜交上的探針，延伸并連接雜交上的探針進行PCR擴增。利用AMPure XP 純化PCR完成后的產物并進行質控，上機檢測。高通量二代測序實驗主要檢測54個白血病相關基因，見表1。

1.4體外藥物敏感性檢測分離、提取的單個核細胞計數后按照1×105～1×106個細胞/1ml在細胞加樣槽中充分混勻后，采用Corning 384孔不透明白色細胞培養板進行培養，每孔體積50 μl，細胞數目為5×103～5×104。采用JANUS@ automated workstation (美國Perkin Elmer Inc公司) 進行加藥，藥物名稱見表2, 每孔0.1 μl，給藥后37 ℃、5% CO2培養箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 細胞增殖熒光檢測試劑，靜置10 min，Envision Plate-Reader讀數。

表1 基因檢測列表

表2 藥物篩查列表 (81種)

1.5統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1二代測序實驗結果74例AML患者中11例發生TET2基因突變，見表3,11例TET2突變患者中有5例患者同時發生ASXL1基因突變,其余63例患者基因檢測結果顯示均未發現TET2基因突變。

2.2高通量體外藥敏實驗結果對于81種藥物進行檢測分析, 表明柔紅霉素耐藥性最高, 結果顯示11例TET2基因突變陽性患者中9例(81.82%)對柔紅霉素不敏感，63例TET2基因突變陰性患者中僅4例(6.35%)對柔紅霉素不敏感，兩組結果差異有統計學意義(χ2=31.805，P<0.05)。在TET2基因突變陽性的11例患者中，10例采用柔紅霉素+阿糖胞苷(DA)方案化療，具體為柔紅霉素45 mg/m2第1～3天,阿糖胞苷100 mg/m2第1～7天,1例放棄治療，3例完全緩解，7例未緩解，耐藥率為70%，見表4。體外藥敏試驗中耐藥率與患者未緩解率差異無統計學意義。

3 討論

TET2定位于染色體4q24的斷裂點[6]，在體內廣泛表達，編碼TET2蛋白，阻止細胞的不可控生長，進而阻止腫瘤形成。TET2突變能使TET2蛋白功能丟失，從而導致造血干細胞異常的增殖和分化。近幾年在多種血液惡性疾病中發現TET2基因突變。TET2常見的突變類型有錯義突變，無義突變，移碼突變及短小插入缺失等[6]。TET2突變最常發生于外顯子3和11，突變位置與TET酶的功能結構域緊密相關，在催化結構CD和DSBH的突變會引起蛋白質的錯誤折疊和氨基酸的替換，產生無功能蛋白，從而導致腫瘤形成[7]。目前研究[8]推測TET2突變主要分為兩類：一類為在骨髓增殖性腫瘤、骨髓增生異常綜合征和繼發性急性髓系白血病中的突變，預后意義尚不明確；另一類為在慢性粒-單核細胞白血病和原發性急性髓系白血病中的突變，此類突變具有強致病性和侵襲性，可直接影響患者預后。在一項對原發性AML的大規模研究中，Metzeler et al[9]發現TET2的突變率為23%，隨年齡增長，TET2突變率增加。更重要的是研究發現核型正常的AML患者，若伴有TET2突變則預后不良。Abdel-Wahab et al[10]檢測了91例AML患者，其中11例發生TET2突變，突變率為12%，而且發現TET2突變患者5年生存率顯著低于無突變患者。Cher et al[11]發現72例AML患者中有8例發生TET2突變，突變率11%，且無病生存率減低。Nibourel et al[12]發現111例完全緩解的AML患者中有19例檢測到TET2突變，36例沒有完全緩解的AML患者中有19例檢測到TET2突變。這些研究結果也表明TET2突變可以作為臨床AML危險分層的新的生物學標志。魏計鋒 等[13]在96例患者中檢測到13例TET2突變，突變率為13.54%。本研究對74例AML患者中54種白血病相關基因進行高通量測序，TET2基因突變率相對較高，11例患者存在該突變，突變率為14.86%，與國內外研究[10-13]結果相似。另外，這11例患者中有5例伴有ASXL1突變。ASXL1基因定位于染色體20q11,編碼一個長為1 541個氨基酸的核蛋白，參與組蛋白甲基化調控。在AML中，ASXL1突變易發生在老年男性患者，并與8號染色體三倍體、RUNX1突變及HLA-DR和CD34的表達相關，該基因與耐藥性的產生是否具有相關性，仍需進一步研究明確。

表3 11例TET2患者基本信息

表4 11例TET2患者基因突變及用藥信息

為了明確TET2基因突變與白血病患者耐藥性產生之間的相關性，本研究隨后使用74例AML患者外周血進行體外藥敏試驗，檢測其對于常見化療藥物的敏感性，結果顯示對柔紅霉素耐藥的比例最高。柔紅霉素是蒽環類化療藥物，是周期非特異性化療藥物，具有較強的抗腫瘤性，并在AML中有較高的完全緩解率和較低的復發率，且與其他蒽環類藥物無交叉耐藥現象，半衰期長。柔紅霉素聯合阿糖胞苷聯合化療方案目前臨床誘導治療AML的主要方案之一，其中柔紅霉素起著重要作用。目前幾乎所有的一線標準方案中都含有柔紅霉素[14]，其作用機制在于影響細胞的核酸合成，與DNA結合，阻礙DNA合成和依賴DNA的RNA的合成反應。DNA拓撲異構酶Ⅱ是其重要靶點。DNR干擾拓撲異構酶Ⅱ將DNA斷端重新接合，造成DNA損傷，導致細胞凋亡[15]。目前報道[16]顯示，臨床正在使用柔紅霉素時，也有部分患者出現柔紅霉素耐藥。其耐藥機制尚不明確，可能與NF-κB異常活化、IκB降低，致使細胞內耐藥基因P-gp/mdrl等的表達增多有關。多項研究[17]結果顯示，柔紅霉素療效存在一定的個體差異。目前認為表觀遺傳學可能影響柔紅霉素的療效，如DNA甲基化，組蛋白修飾，microRNA 的表達等都影響了機體對柔紅霉素的反應，成為研究熱點，而且在臨床治療中也確實存在使用柔紅霉素方案療效欠佳。在本研究中，11例TET2基因突變陽性患者中，有9例對柔紅霉素不敏感，而63例TET2基因突變陰性患者中僅有4例對柔紅霉素不敏感，差異有統計學意義，這表明有TET2基因的突變可能有助于患者對柔紅霉素產生耐藥性。由于體內腫瘤微環境等因素的影響，可能體外試驗并不一定與藥物的實際臨床療效完全等同，因此，本研究又同時將11例TET2基因突變陽性患者對于DA方案的實際療效與體外藥敏試驗進行對比，由于1例患者未行化療，因而無法對其判斷療效，僅將另外10例患者的體外藥敏試驗與實際臨床療效進行對比，結果顯示差異無統計學意義。

根據本研究結果，推測TET2基因突變可能確實增加了AML對柔紅霉素產生耐藥性的風險。然而，由于本研究中TET2基因突變陽性的患者數較少，導致本研究的結果具有一定的局限性，將會在今后的研究中進一步提高樣本數，明確是否在大樣本的研究中能夠得到相同的結果。本研究為今后的工作提供了一個方向，可以建立動物模型，研究發生機制，使基因檢測與藥敏實驗更好結合，對精準醫療，尤其是急性白血病個體化治療提供依據，從而提高治療的有效率，有較高的臨床指導意義及應用前景。

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