高通量基因測序技術在自然流產胎兒絨毛染色體的核型分析

方有燕，吳 歡，賀小進，陳大蔚，周一茹，周 平，曹云霞，魏兆蓮

近年，輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)在個體化控制性超促排卵方案的應用、實驗室技術以及儀器設備方面均取得了長足的進步，ART術后的臨床妊娠率有了很大的提高，但高流產率仍是一個亟待解決的問題。常見的流產病因包括遺傳因素、免疫因素、內分泌、生殖道感染、生殖道畸形及高凝血狀態等，其中遺傳因素尤其染色體異常被認為是最常見早期流產誘發因素[1]。絨毛細胞來源于胚胎外胚層細胞，具有與胚胎組織相同的遺傳特性，因此可通過檢測自然流產組織染色體核型，了解胚胎細胞的遺傳性狀，分析胚胎停育的可能病因。既往關于胚停絨毛染色體分析多采用傳統的染色體顯帶和熒光原位雜交技術,且關于不同病因ART流產組織染色體分析鮮有報道。該研究采用高通量測序技術分析364例自然流產絨毛組織染色體異常的發生率、核型分布及與孕婦年齡、胎兒性別、妊娠方式、不同ART病因之間的關系，報道如下。

1 材料與方法

1.1病例資料選擇2014年9月～2016年12月于安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科生殖中心行胎兒絨毛染色體檢測的364例患者作為研究對象，年齡19～44(30.440±4.768)歲，孕5～15周，其中13～15周僅1例。根據妊娠方式，將其分為自然妊娠組及ART組。364例患者中自然妊娠246例，ART術后妊娠118例，B超提示胚胎停止發育(未見胚芽或未見心管搏動)，在取得患者知情同意的前提下采集胚胎絨毛標本并行高通量測序。

1.2高通量測序法檢測絨毛染色體核型① 提取基因組DNA，Wizard試劑盒進行產物純化，Qubit法檢測純化后的產物；② 構建基因組DNA小片段文庫：采用Life Tech的ION XPRESS LIBRARY KIT進行DNA片段化，并構建DNA小片段文庫；③ 按照PGM測序操作指南(Ion PGM-200 Sequencing Kit V2 only)進行高通量測序及信息分析。

2 結果

2.1樣本總體檢測結果364例絨毛組織中檢出染色體數目及結構異常178例，異常率為48.90%(178/364)，其中自然妊娠組130例，異常率52.85%(130/246)，顯著高于ART組的40.68%(48/118)(P<0.05)。異常核型以常染色體三體型為主，占異常核型的65.17%；其次為染色體結構微缺失/微重復，占15.73%；性染色體單體占6.74%；三倍體占5.06%；嵌合體占3.93%。除1、6、11號染色體外非整倍體的發生涉及所有染色體，其中16號染色體發生率最高，占異常染色體的21.35%；22號染色體次之，占11.24%；常染色體的非整倍體多為三體型，性染色體的非整倍體則以單體型為多，僅有1例常染色體單體，核型為45，XY,-21。見表1。

表1 早期自然流產絨毛組織染色體異常核型及分布

2.2年齡與染色體異常ART組≥35歲流產絨毛組織染色體異常發生率雖高于<35歲患者，但差異無統計學意義；自然妊娠組≥35歲流產絨毛組織染色體異常發生率顯著高于<35歲患者(P<0.05)。見表2。

表2 年齡與染色體異常

2.3ART助孕病因與胚胎染色體異常ART組流產胎兒絨毛染色體異常率為40.68%(48/118)，以復發性流產最常見，占60.00%，其次為男方因素，占48.39%。見表3。經χ2檢驗，差異無統計學意義，尚不能表明ART組不同病因染色體異常率不同。

表3 ART助孕妊娠組不同病因分布

2.4性別與胚胎染色體異常核型分布362例胚停組織中(其中2例因測試時要求保密，具體性別不詳，予以排除，其中1例核型異常)，男胚166例，女胚196例，男胚異常核型占總異常核型的53.11%(94/177),顯著高于女胚的46.89%(83/177)(P=0.007)。在177例異常染色體核型中，常染色體三體型占65.64%(116/177)，其中男胚63例，女胚53例。按照染色體非顯帶核型對三體核型進行分組，將其分為A、B、C、D、E、F、G 7組，詳見表4，男、女胚均主要分布于E組(38.10%vs37.74%) 和G組(22.22%vs30.19%)；男胚A組三體核型顯著多于女胚(P<0.05)，其余各組在性別間分布差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

3 討論

絨毛滋養層細胞是受精卵有絲分裂的衍生物，因其與胎兒組織具有相同的遺傳性狀，故可以作為檢測早期胎兒染色體異常的材料，對自然流產的遺傳學病因做出診斷，為胚停夫婦再次妊娠的遺傳咨詢提供信息。

表4 不同性別胚胎染色體非顯帶核型分組分布

自然流產的發生率約占所有妊娠的15%～20%，是妊娠期常見的并發癥[2]。自然流產多發生于妊娠早期，導致流產的病因眾多，其中染色體異常占50%～70%[3]，是導致胚胎早期流產的主要原因，因為染色體數目異常的胚胎遺傳缺陷更大，導致遺傳物質不平衡，致死性更高[3-4]。有研究者認為常染色體三體以16號染色體三體最常見，約占1/3，且具有高致死性[2,5]。本研究結果顯示，染色體數目異常發生率為41.21%(150/364)，其中16號染色體三體發生率為32.76%(38/116)，與相關研究[2,5]報道一致。45，X0是人類唯一能生存的單體綜合征[6]，本研究中，45，X0核型有12例，占所有異常染色體核型的6.74%，該異常核型的形成除與減數分裂時性染色體不分離導致一條染色體缺失有關外，多由于父系性染色體丟失所致。通過對116例常染色體三體核型按染色體非顯帶核型圖進行分組，顯示男胚、女胚均主要分布在E、G兩組，這可能與常染色體三體主要為16、22號染色體異常，而16、22號染色體分別位于E、G兩組有關。本研究中男胚A組三體核型顯著多于女胚，因樣本量小，尚不足以得出結論，仍需擴大樣本量進一步研究證實。

本研究中自然妊娠組年齡小于ART組，但絨毛染色體異常的發生率卻高于ART組(52.85%vs40.68%),可能與行ART患者的配子及胚胎經體外優化、篩選后染色體異常率降低有關。有研究[5,7]顯示，20～24歲、40～44歲、45歲及以上流產率分別為10%、51%、75%，≥39歲年齡組約占總人數的25%，21三體綜合征的發生率占1.44%，顯著高于35～38歲年齡組的0.65%。這些研究[5,7]表明，隨著年齡增長，不僅流產率增加，染色體異常率也明顯增高。本研究結果也證實，自然妊娠組≥35歲患者染色體異常率高達73.68%，顯著高于<35歲的48.99%。ART組不同年齡間染色體異常率差異無統計學意義，可能與ART組≥35歲例數偏少有關，尚需擴大樣本量進一步驗證。

有研究[8]表明，不明原因性妊娠丟失與精子染色質的高頻組裝異常有關。本研究ART組中男方因素主要包括少、弱、畸形精子癥、單/雙側輸精管缺如、梗阻性無精子癥等，其染色體異常發生率高達48.39%，可能與該組患者DNA碎片指數較高有關,García-Ferreyra et al[9]研究表明，DNA碎片指數較高組(37.10±17.61)胚胎染色體非整倍體率顯著高于DNA碎片指數較低組(21.3±13.48，17.4±10.79)(73.9%vs61.1%vs59.1%)，由于精子核染色質的去凝作用以及隨后形成的雄原核對正常受精和胚胎發育都至關重要，精子DNA碎片指數高表明染色質損傷，可降低受精能力和胚胎發育潛能，最終導致妊娠丟失[8]。因此對ART后的早期流產應充分考慮到男方精子染色體異常因素，術前應常規檢查男方精子染色體有無異常，以避免或減少早期妊娠丟失。

本研究中多囊卵巢綜合征(polycystic ovar syndrome,PCOS)患者絨毛染色體異常發生率為30.00%，明顯低于復發性流產和男方因素的患者，與Wang et al[10]報道的結果一致(胚停組織染色體非整倍體發生率為28.1%)，結果表明，雖然PCOS患者早期流產率高達50%，但染色體非整倍性可能并不是其早期流產的主要原因，而母體內分泌因素(如高黃體生成素水平、高雄激素水平、孕酮產物異常、胰島素抵抗)及其導致的子宮內膜容受性降低可能是PCOS患者早期流產的主要風險因素。子宮內膜異位癥患者染色體異常發生率與PCOS患者相近(30.77%)，可能與子宮內膜異位病灶的炎癥反應、細胞因子的異常改變影響卵子成熟和質量以及子宮內膜容受性降低有關[11]。

早期自然流產除表現為染色體異常率增高，還存在性別特異性胚胎淘汰現象[12]。本研究362例絨毛組織中，胚停女胚占比高于男胚(196vs166)，但男胚異常核型占比高于女胚(53.11%vs46.89%)，與其他研究者的報道[13-14]一致，具體機制尚不清楚。

此外，本研究發現染色體結構異常占有較高的比重(7.69%)，占所有異常染色體核型的15.73%，因此應重視早期流產染色體的結果異常。這可能與高通量測序技術相比于傳統染色體核型分析和熒光原位雜交技術具有更高的檢測深度和準確度有關。高通量測序技術可檢測到0.5 Mbp以上的染色體片段缺失，能發現更多的染色體片段微缺失和微重復等結構異常。

綜上所述，自然流產胚胎染色體異常核型率高于ART組；年齡與胚胎染色體異常率增高有關；染色體數目異常是導致胚胎早期流產的主要原因，16號染色體三體是最常見的胚胎染色體數目異常；胚停女胚占比高于男胚，但男胚異常核型占比高于女胚；應重視不明原因妊娠丟失的男方精子染色體異常。高通量測序技術相較于傳統染色體核型分析和熒光原位雜交技術具有更高的檢測深度和準確度，能發現更多的染色體結構和數目異常，對闡明早期流產的遺傳學病因及再次妊娠的遺傳咨詢具有重要意義。

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