小檗堿對三轉基因阿爾茨海默病小鼠的學習記憶和海馬PSD95突觸相關蛋白表達水平的影響

常鑫　梁宇彬　車思璇　黃敏　曾思琳　陳思言　郭毅

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種隱匿性起病的神經變性疾病，患者主要表現以近期記憶力下降，伴有行為障礙和認知障礙，后期還可以表現為精神行為異常[1]。AD以神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs )由過度磷酸化的不可溶性Tau蛋白形成以及神經炎性淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑(senile plaque，SP )為主要兩大病因學說，其中還有神經凋亡學說、神經突觸丟失、氧化應激學說等[2]。突觸后致密蛋白95[3](postsynaptic denisty protein 95，PSD95)是神經元的突觸核心蛋白，記憶的保存與形成有賴于突觸蛋白結構完整性和可塑性。目前治療仍未發現治療AD的有效藥物，因此研發治療AD的有效藥物是亟待解決的問題。小檗堿[4](Berberine，BBR)是黃連素一類的生物類堿，BBR具有多種的藥理作用效果，包括明顯的抗炎作用、抗病毒、抑菌及降糖、降脂等作用。一些研究表明BBR能改善AD的癥狀并減輕其病理學表現[5]。因此，本實驗采用新型的三轉基因(3×Tg)小鼠作為AD的動物模型，選擇8月齡的3×Tg-AD小鼠以進一步探討BBR對海馬PSD95表達水平的影響及與微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)自噬水平、磷酸化蛋白激酶B(phos-phorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白[phosphorylated manmmalian target of sirolimus(Rapamycin)，p-mTOR]信號通路的關系，探索小檗堿改善AD的臨床癥狀并分析其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗對象30只雄性的三轉基因AD小鼠購自美國Jax動物實驗室，它能穩定性表達人源突變基因APPswe、TauP30IL以及鼠源突變基因的PS1M146V，體重(30.32±2.50)g，在標準條件下飼養。該8月齡的三轉基因AD小鼠具有認知功能下降、老年斑沉積、神經突觸丟失等特征。

1.2實驗相關試劑、材料小檗堿購自武漢福鑫化工有限公司；即用型免疫組織化學試劑盒購自深圳賽百科生物技術有限公司；蔗糖、多聚甲醛、戊二醛、鹽酸、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、水合氯醛、甲醇、乙醇、鹽酸、PBS等均購自深圳生物化學試劑公司；一抗：PSD95、GAPDH購自美國Abcam公司，p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)以及Akt、mTOR、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)購自CST公司。二抗：兔抗鼠DL488熒光二抗購自南京森貝伽生物有限公司，鼠二抗、鼠二抗購自美國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1分組及給藥處理將30只雄性8月齡的三轉基因AD小鼠隨機分為3組，即AD對照組、AD+20 mgBBR組和AD+50 mgBBR組，每組各10只，給藥劑量方式分別為小檗堿25 mg·kg-1·d-1、小檗堿50 mg·kg-1·d-1，AD對照組給予等容量生理鹽水灌胃，連續干預3個月。

1.3.2行為學檢測小檗堿灌胃3月后對各組AD小鼠進行Morris水迷宮行為學測試。Morris水迷宮實驗分為定位航行及空間探索兩部分。其中定位航行經歷5 d，空間探索為2 d。定位航行第1 d為試練期：把小鼠置于平臺停留10 s，隨后把小鼠從4個不同象限的對應位置面壁放入池內，小鼠登上平臺且停留2 s后終止記錄，最長記錄時間為60 s，若AD小鼠在60 s內仍不能上臺，將其引致平臺停留10 s，以便適應平臺；上述行為學檢測循環4個象限，訓練定位航行；定位航行第2～5 d為檢測期。空間探索實驗：在第7 d將平臺撤走并把各組的三轉基因AD小鼠從一處放入水中，同時觀察60 s內小鼠通過原平臺位置次數和在原平臺所在象限的停留時間百分比[6]。通過水迷宮跟蹤系統得出數據，利用Graphpad Prism 5軟件進行數據整理作圖分析。

1.3.3免疫熒光實驗測試PSD95陽性表達水平將培養7 d后的各組原代細胞培養基移去，將PBS洗滌3次后將40 g/L多聚甲醛放置培養皿上固定1 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、43 ℃水浴展片、撈片、37 ℃烘箱烤片，脫蠟，采用SABC方法進行免疫組化染色。將PSD95(1∶400比例)抗體稀釋作為一抗， 二抗室溫孵育1 h，熒光抗淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，以鏡下觀察PSD95陽性表達水平。

1.3.4Western blotting檢測各蛋白表達水平小檗堿藥物處理3個月后各組取4只小鼠斷頭取腦，在無菌條件下在顯微鏡下剝離血管膜和取出完整的海馬組織放入無菌EP管中，按照質量比例加入蛋白提取試劑盒。超聲破碎組織、離心，取上清即為可溶性蛋白(TBS-soluble),分裝凍存至-80 ℃冰箱；采用BCA法對樣品進行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉印到PVDF膜上；80 mV電泳120 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加PSD95(1∶3000)、LC3-Ⅱ(1∶3000)、p-Akt(1∶5000)、p-mTOR(1∶5000)，4 ℃過夜；TBST 漂洗次3 次；加入1:5000兔二抗、鼠二抗室溫孵育2 h；TBST 漂洗3 次，10 min/次；ECL發光液顯影。利用Quantity One凝膠定量軟件進行吸光度值分析，利用Prism5軟件作圖片分析。

2　結　果

2.1檢測行為學的實驗Morris水迷宮試驗顯示AD+25 mgBBR和AD+50 mgBBR組的逃避潛伏期較AD對照組均減少(P<0.05，P<0.01)，而50 mgBBR組的每天逃避潛伏期較AD+25 mgBBR組較減少(P<0.05)；同時各組小鼠的游泳速度沒有明顯差異(P>0.05)。空間探索：AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的所在象限停留時間及跨越原平臺的次數較AD對照組均增加(P<0.05,P<0.01)，且AD+50 mgBBR組更為明顯(圖1)。

2.2免疫熒光檢測PSD95陽性表達水平AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的三轉基因小鼠海馬組織中CA1區的免疫陽性反應呈綠色熒光散點，AD+25mgBBR組呈細小點狀連接成片，個別細胞有散在綠色熒光包圍，AD+50 mgBBR組的綠色熒光顆粒染色較多、較深，多個細胞有綠色熒光包圍；AD對照組三轉基因小鼠海馬組織中CA1區的免疫陽性反應呈淺綠色，散在細點、稀疏(圖2)。

圖1　A為各組小鼠逃避潛伏期、游泳速度；B為各組小鼠通過平臺的次數、原平臺所停留的時間百分比(%)；與AD對照組?P<0．05，??P<0．01，#P<0．05(n=10)

圖2　PSD95在各組小鼠海馬組織CA1區的表達情況(DAB×400倍與AD對照組比較，??P<0．01，n=4)

2.3Western blotting實驗與AD對照組比較,AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的PSD95突觸蛋白水平均升高(P<0.01)(圖3)；AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的自噬水平LC3-Ⅱ較AD對照組升高(P<0.05)(圖3)；AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的p-Akt、p-mTOR的表達水平較AD對照組均明顯升高(P<0.05)(圖3)。

3　討　論

本實驗選取可過表達人源突變基因APP/Tau/PS1的三轉基因AD小鼠可較好地作為AD病理模型。該三轉基因AD小鼠[7]從4月齡漸開始出現AD的初期病理表現如老年斑Aβ的沉積、tau蛋白過度磷酸化、神經異常凋亡、神經突觸丟失及突觸結構的破壞，該8月齡AD小鼠逐漸表現出學習記憶受損、易激怒等行為學上的改變。小檗堿[8]是一種天然的生物堿，有抗炎、抗凋亡、降脂等多種藥理作用。最近研究表明小檗堿能改善AD的病理如減少老年斑Aβ沉積、減少tua蛋白過度磷酸化等，目前作為神經退行性疾病的預防用藥備受關注。本實驗予小檗堿兩種不同的劑量，分別是25 mg、50 mg干預該8月齡的三轉基因AD小鼠，Morris水迷宮行為學檢測提示小檗堿組的逃避潛伏期及停留原平臺所占的時間較AD對照組均縮短，提示小檗堿能改善三轉基因AD小鼠的學習記憶、空間探索能力。

突觸后致密蛋白(PSD)[9]是特定的突觸連接細胞骨架，是突觸后信號轉導機制的重要組成部分；PSD95是PSD基本結構蛋白，分子量為95kDa，能在N-甲基D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)和突觸膜表面蛋白之間起誘導作用，對神經突觸傳來的興奮性信號轉導能快速進行整合[10]。PSD95能增強突觸可塑性、突觸的完整性，且在學習記憶過程中起關鍵作用。對抑制PSD95表達的小鼠會出現學習記憶能力障礙、突觸數量丟失及完整性缺失[11]。本實驗發現三轉基因AD小鼠給予小檗堿干預后其腦部的海馬組織中PSD95蛋白表達水平增高，同時能增強其學習記憶、空間探索能力。

LC3-Ⅱ是自噬過程中產生的自噬膜結構，是反映自噬水平主要標志物[12]，自噬主要是清除異常蛋白物質(如Aβ)、過度磷酸化纖維纏結及受損細胞器的過程，在AD病程中發現自噬水平卻呈下降趨勢，而病理的Aβ沉積毒性、神經纖維纏結的沉積加重了AD病理進程；本實驗提示小檗堿干預后的三轉基因AD小鼠腦部海馬的LC3-Ⅱ水平呈升高趨勢，提示小檗堿能升高其自噬水平，提高清除、吞噬Aβ、受損細胞器等異常物質的能力。有研究還表明通過自噬水平[13]誘導激活雷帕霉素和Akt/mTOR信號能抵抗淀粉樣蛋白-β沉積及抗氧化應激，保護神經突觸(PSD95)可塑性、增加其神經傳遞功能。mTOR是負責轉錄、翻譯生長因子、胰島素整合及腦源性營養因子的蛋白合成[14]，Akt[15]信號是其上游因子，促進mTOR信號激活，增加PSD95等蛋白表達。mTOR[16]還具有營養神經因子的作用，營養神經因子的起始通路是Akt/mTOR，本實驗通過小檗堿干預AD小鼠后使Akt/mTOR信號通路表達增加，提示小檗堿具有營養神經因子的作用，同時上調mTOR表達水平能增加PSD95的表達[17]，同時能保護神經突觸的完整性、提高其可塑性。

圖3　各組小鼠WB檢測　1為AD對照組；2為AD+25mgBBR組；3為AD+50mgBBR組(n=4)；A為各組小鼠的PSD95表達水平；B為各組小鼠的自噬LC3?Ⅱ水平；C為各組小鼠的p?Akt、p?mTOR蛋白表達水平；與AD對照組比較，?P<0．05，??P<0．01

綜上所述，應用50 mg劑量的小檗堿能有效改善三轉基因AD小鼠的學習記憶、空間探索能力，增加突觸后致密蛋白PSD95表達，其可能機制是小檗

堿通過增加自噬水平來上調Akt/mTOR信號通路保護神經元突觸的可塑性、結構的完整性，但調控突觸蛋白表達的具體機制仍需進一步探索。

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