Lyn對屋塵螨誘導的人支氣管上皮細胞中MUC5AC表達的影響及其機制

王孝蕓，藍　楠，唐紅梅，袁謝芳，王　星，李國平

(1.西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室， 四川 瀘州 646000；2. 西南醫科大學附屬醫院呼吸內一科，四川 瀘州 646000 )

哮喘是當前世界面臨的重要健康問題，其發病率和死亡率逐年上升。氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，在重癥哮喘發作時尤其明顯。如何抑制黏液高分泌成為哮喘防治需解決的關鍵問題[1]。氣道黏液是一種膠狀液體，分布于氣道表面，是氣道上皮細胞的物理屏障。然而過度的黏液分泌和黏液清除下降可導致黏液在氣道聚集和阻塞氣道，導致患者明顯咳嗽和呼吸困難，并增加患者死亡率。近年研究[2]顯示：黏液高分泌可引起氣道高反應，阻礙炎癥的逆轉和多余黏液的清除。黏蛋白是黏液中的主要蛋白成分，是一種糖基化蛋白，其編碼基因為MUC，迄今為止已發現11種黏蛋白基因(MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8，MUC13和MUC19)在肺部表達[3-4]。氣道黏蛋白主要包括MUC2、MUC4、MUC5AC和MUC5B。MUC5AC和MUC5B在氣道表達最多，尤其是MUC5AC，在氣道杯狀細胞中高表達，是黏液細胞增生和化生的標志。輕中度哮喘患者主要產生富含MUC5AC黏蛋白的黏液，致死性哮喘患者明顯存在MUC5AC和MUC5B高表達[5-6]。

MUC5AC產生主要通過白細胞介素13(IL-13)/白細胞介素4受體α(interleukin-4 receptor α,IL-4Rα)復合物和表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)2條途徑來調節。白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)和IL-13均屬于輔助性T細胞(helper T cell)2型細胞因子(Th2)，在哮喘的發生和發展中發揮重要作用，二者均通過IL-4Rα傳遞信號。IL-4R途徑與信號傳導及轉錄激活因子6(signal transducers and activators of transcription 6,STAT6)活化有關。研究[7]顯示：在小鼠氣道Clara細胞中，過敏原介導的黏液高分泌依賴于Clara細胞的IL-4Rα信號途徑。近來研究[8]顯示：IL-4還可通過介導含脂筏的小窩蛋白的聚集影響人支氣管上皮細胞中MUC5AC的合成。信號轉錄子與轉錄活化子STAT6在IL-13的活化下激活，引起MUC5AC產生、黏液腺化生和氣道高反應性[7]。屋塵螨(house dust mite,HDM)在過敏性哮喘中起著重要作用，是過敏性哮喘發生的重要致敏原。研究[9]顯示:在過敏性炎癥中HDM可以破壞上皮細胞黏膜屏障并且激活T細胞，引起IL-4和IL-13等Th2型細胞因子的產生。另有研究[10]顯示亞洲沙塵螨可引起小鼠氣道上皮細胞中MUC5AC的高表達從而影響氣道黏液分泌。有研究[11]顯示：HDM可通過EGFR信號途徑破壞氣道上皮屏障功能。受體酪氨酸蛋白激酶是細胞信號傳導的關鍵信號酶，在免疫應答和炎癥反應等過程中起著重要的生理病理作用。Lyn激酶是非受體酪氨酸激酶Src家族成員之一。Lyn與許多信號途徑有關，參與了哮喘炎癥與氣道重塑發生，但在哮喘發病中的具體機制不明。本研究構建人MUC5AC啟動子熒光素酶報告基因，觀察在HDM刺激作用下Lyn激酶對MUC5AC表達的影響及Lyn對MUC5AC表達的調節是否依賴于調節STAT6途徑。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器16HBE細胞為本實驗室保存。限制性內切酶(美國MBI公司)，T4DNA連接酶、dNTP、Taq酶及buffer(中國TaKaRa公司)，高糖DMEM(中國Hyclone公司)，OPTI-MEM和胎牛血清(美國Gibco公司)，脂質體2000(美國Invitrogen公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)，HDM提取液(美國GEER公司)，pRL-TK質粒(中國百替生物公司)，BCA蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和預染蛋白質相對分子質量標準(中國Beyotime公司)，LynsiRNA、MUC5AC一抗、STAT6一抗和辣根過氧化物酶二抗(美國SantaCruz公司)，FITC標記二抗(英國Abcam公司)，Western blotting化學發光液(美國Millipore公司)。水平電泳儀(中國天能公司)，熒光報告檢測儀(美國Promega公司)，細胞培養箱(日本Sanyo公司)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2構建人MUC5AC啟動子熒光報告基因通過NCBI基因數據庫確定MUC5AC基因啟動子區域(-1300/+48)，設計擴增-1300/+48啟動子的引物，應用基因重組及PCR等技術，構建人MUC5AC啟動子熒光報告基因(pGL3-hMUC5AC/-1300/+48)。

1.3雙熒光素酶報告基因檢測① 用含5%胎牛血清的高糖DMEM培養基于24孔板培養16HBE細胞，培養條件為37℃、5%CO2。細胞設PBS組和HDM組待細胞融合度為40%～50%時，用LynsiRNA分別轉染對照組和HDM組細胞。待細胞繼續生長至融合度為80%～90%時，用Invitrogen脂質體2000試劑盒將pGL3-hMUC5AC/-1300/+48和pRL-TK二質粒轉染至16HBE細胞。轉染步驟如下：a.用50 μL OPti-MEM培養基稀釋相應的DNA或者RNA；b.用50 μL OPti-MEM稀釋適量的脂質體，室溫靜置5 min；c.稀釋的DNA或RNA和脂質體混勻，室溫靜置20 min；d.將混合物加至24孔板，輕輕吹勻，前后搖動24孔板。② 棄掉舊培養基，用PBS清洗2次。加不含抗生素和血清的高糖DMEM培養基繼續培養，并用1 μg·L-1的 HDM提取液刺激轉染質粒后的細胞24 h，然后采用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測16HBE細胞中pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的相對熒光素酶活性(relative luciferase unit,RLU)。RLU=RLU1/RLU2,RLU1為螢火蟲熒光素酶反應強度，RLU2為內參海腎熒光素酶反應強度。

1.4免疫熒光法檢測16HBE細胞中MUC5AC表達水平① 用共聚焦培養皿培養16HBE細胞，分為LynsiRNA轉染組和非LynsiRNA轉染組。細胞融合度為40%～50%時，用Invitrogen脂質體2000試劑盒進行LynsiRNA轉染，37℃培養(轉染方法如前所述)。轉染4 h后換含血清的新鮮DMEM。采用濃度為1 μg·L-1的HDM刺激細胞24 h，同時設PBS對照組。② 加4%多聚甲醛固定30 min，用0.2%Triton穿孔15 min，PBS漂洗2次，每次5 min；用1%BSA封閉30 min；加抗MUC5AC抗體(1∶100)于4℃孵育過夜，PBS漂洗；加FITC標

記的二抗(1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，在Leica共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞中MUC5AC表達水平。MUC5AC表達水平以相對熒光強度表示，采用Leica共聚焦顯微鏡自帶軟件分析。

1.5Western blotting檢測16HBE細胞中STAT6表達水平① 用60 mm培養皿培養16HBE細胞，分為LynsiRNA轉染組和非LynsiRNA轉染組，轉染步驟按Invitrogen脂質體2000試劑盒說明操作，轉染4 h后換含血清的新鮮DMEM。用濃度為1 μg·L-1的HDM分別刺激LynsiRNA干擾組和非LynsiRNA干擾組細胞24 h，并設PBS對照組。② 去除培養液，PBS漂洗，每個培養皿加300 μL Western blotting及IP細胞裂解液和3 μL的PMSF，冰上靜置5 min。用細胞刮刮下細胞，將裂解的細胞轉移到1.5 mL EP管并離心10 min(4℃、12 000 r·min-1)。將上清液轉移到新EP管，加5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，冷卻后-20℃保存。③ 用BCA蛋白濃度試劑盒測定各組蛋白濃度；配制10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每孔加20 μg蛋白樣品；100 V恒壓垂直電泳90 min；將分離的蛋白用Bio-Rad濕轉儀轉到PVDF膜上，轉膜條件為100 mA恒流轉膜4 h；用5%的脫脂奶粉封閉膜上非特異性位點，封閉時間為1 h；分別加內參β-actin和STAT6一抗(1∶200)，4℃孵育過夜；用TBST緩沖液漂洗2次，每次10 min；加相應的二抗(1∶800)，室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗如前；最后加辣根過氧化物酶標記的化學發光液，采用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc Touch 成像系統曝光成像。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶的相對灰度值(以β-actin為內參)，以STAT6/β-actin表示STAT6表達水平。

2　結　果

2.1pGL3-MUC5AC/-1300/+48載體構建將pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48片段亞克隆至pGL3-enhance載體，陽性克隆經KnpⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1300/+48片段帶和約5 000 bp的載體帶。見圖1。

Lane 1: DNA marker; Lane 2: pGL3-MUC5AC/-1300/+48; M: DNA marker 2 000 bp plus.

圖1pGL3-MUC5AC/-1300/+48酶切鑒定

Fig.1Identification of pGL3-MUC5AC/-1300/+48 with restriction enzyme digestion

2.2pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的RLUHDM組pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的RLU高于PBS組(PBS組：4.210±0.036；HDM組：7.030±0.176)(P<0.05)；LynsiRNA干擾HDM組細胞后，RLU明顯升高(HDM組：7.030±0.176；HDM LynsiRNA組：10.080±0.442)(P<0.05)。

2.3各組16HBE細胞中MUC5AC表達水平采用濃度為1 μg·L-1的 HDM刺激16HBE細胞24 h后，采用免疫熒光法檢測各組細胞中MUC5AC表達水平，共聚焦顯微鏡觀察結果見圖2(插頁一)。HDM組16HBE細胞中MUC5AC表達水平高于PBS組(PBS組:29.480±1.581; HDM組：66.700±2.780)(P<0.05)；LynsiRNA干擾HDM組細胞后，其MUC5AC表達水平高于未干擾時(HDM組：66.70±2.78；HDM LynsiRNA組:93.61±2.65)(P<0.05)。

2.4各組16HBE細胞中STAT6表達水平采用Western blotting法檢測HDM刺激下人支氣管上皮細胞(16HBE)中STAT6的表達水平。LynsiRNA干擾后HDM組細胞中STAT6表達水平(118.98±1.77)高于未干擾時(88.23±2.04)(P<0.05)。見圖3。

Lane 1:PBS group; Lane 2:PBS+LynsiRNA group; Lane 3:HDM group; Lane 4:HDM+LynsiRNA group.

圖3Western blotting法檢測各組16HBE細胞中STAT6表達電泳圖

Fig.3Electrophorogram of expressions of STAT6 in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

3　討　論

氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，抑制氣道黏液高分泌是防治哮喘、尤其是嚴重哮喘的關鍵[12-13]。黏蛋白是黏液中的主要蛋白成分，其編碼基因為黏蛋白基因MUC，迄今為止已發現11種黏蛋白基因。已有研究[6,14]顯示：MUC5AC在氣道中表達最多，對氣道黏液高分泌有重要作用,因此對MUC5AC基因表達及其調節機制的研究對于臨床治療哮喘有重要意義。氣道黏液高分泌與IL-4和IL-13等Th2型細胞因子相關，主要通過IL-4Rα途徑傳遞信號。IL-4Rα途徑與STAT6活化密切相關。IL-4Rα途徑可激活JAK3、JAK2 和TYK2等激酶，從而使STAT6磷酸化。磷酸化的STAT6二聚體向核遷移并與IL-4和IL-13啟動子結合，由此影響Th2細胞分化，引起氣道高反應和氣道黏液高分泌[7,15]。HDM是過敏性哮喘的重要致敏原，研究[16]顯示約有50%的哮喘患者對HDM變應原過敏。有研究[9,17]顯示：HDM可破壞氣道上皮屏障，并激活T細胞，引起IL-4和IL-13等細胞因子的釋放，發生以Th2型為主的免疫應答反應。另有研究[10]顯示：亞洲沙塵螨可引起小鼠氣道上皮細胞中MUC5AC的高表達從而影響氣道黏液分泌。但有關HDM和MUC5AC之間關系的研究還很少。本研究采用濃度為1 μg·L-1的重組HDM提取液刺激人支氣管上皮細胞發現：HDM可引起人支氣管上皮細胞中MUC5AC的高表達，說明HDM可誘導氣道黏液高分泌。Lyn屬于Src家族，是一種非受體酪氨酸激酶，在除了T淋巴細胞以外的造血細胞上表達，是細胞信號轉導的關鍵信號酶，在免疫應答和炎癥反應等過程中起著重要的生理病理作用。有研究[18]顯示：Lyn對造血干細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和血小板等具有正向和負向的雙重調節作用。Lyn缺陷小鼠容易發生骨髓增生和免疫性疾病。Lyn基因敲除小鼠出現嚴重和持續的變態反應炎癥、血清IgE水平升高和Th2免疫應答表明：Lyn激酶可能是一個重要的陰性調節Th2免疫應答的激酶，但其具體調節作用不明[19]。有研究[20]顯示IL-13可通過STAT6-TMEM16A-ERK1/2途徑引起MUC5AC高表達。也有研究[21]顯示Rho激酶抑制劑法舒地爾可通過調節STAT6和NF-κB減輕過敏性氣道炎癥和下調MUC5AC的表達。這些研究結果皆提示STAT6在MUC5AC表達中起著重要作用。本研究采用LynsiRNA抑制Lyn在人支氣管上皮細胞的表達，同時采用1 μg·L-1的重組HDM提取液刺激LynsiRNA干擾的人支氣管上皮細胞和正常對照上皮細胞。雙熒光報告基因檢測和免疫熒光檢測結果顯示：采用LynsiRNA干擾人支氣管上皮細胞后，MUC5AC表達要高于正常對照細胞，說明Lyn缺失可增加人支氣管上皮細胞中MUC5AC表達。而Western blotting檢測結果也提示Lyn缺失可能通過上調STAT6的水平增加人支氣管上皮細胞中MUC5AC的表達。

本研究說明Lyn和人支氣管上皮細胞中MUC5AC表達有關，Lyn缺失可通過上調STAT6的水平而增加人支氣管上皮細胞中MUC5AC的表達。本研究結果對闡明Lyn在哮喘氣道黏液高分泌作用機制和發現新的治療靶點具有重要作用。

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