木葡聚糖基溫敏水凝膠預防大鼠腹壁-腸壁再粘連及其對局部TGF-β1和CTGF表達的影響

孫　紅，李碩峰，崔　菁，張二帥，李景武，熊艷杰，馬麗桃，姚芳蓮，車鵬程

(1.華北理工大學基礎醫學院 河北省慢性病重點實驗室 唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北 唐山 063210；2.天津大學化工學院高分子科學與工程系，天津 300350；3.河北省唐山市人民醫院腹盆外科，河北 唐山 063001；4.華北理工大學附屬醫院病理科，河北 唐山 063000)

臨床上對于既已形成的粘連多采用粘連松解手術進行分離，但對粘連組織分離的同時又會造成新的創傷，粘連松解術后再粘連的發生率高達50%，因此對于粘連松解術后預防再粘連的研究具有非常重要的臨床意義[1-2]。目前預防術后粘連的方法大多針對于普通腹腔外科手術后引起的粘連[3-4]，對于粘連機制更加復雜的粘連松解術后再次粘連的預防效果尚不清楚。研究[5-7]顯示:聚乙二醇-聚己內酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG)溫敏凝膠在大鼠腹壁-盲腸缺損模型中均取得了良好的防粘連效果，然而在大鼠腹壁盲腸粘連松解術后的二次損傷模型中卻未能有效地預防再次粘連的發生。

本文作者前期研究[8]表明：木葡聚糖基(mXG)溫敏水凝膠具有可逆的“低溫溶膠，體溫凝膠”溫敏行為，有很好的細胞相容性，對普通手術后的腹腔粘連有優異的防粘連效果。4% mXG溶液溶膠-凝膠轉變溫度為23℃，在37℃下凝膠過程在3 min內即可完成，并且有較高的凝膠強度，因此本文作者推測其對預防粘連松解術后再粘連的發生可能也具有一定的效果。本研究在以往工作的基礎上，進一步評價mXG溫敏水凝膠對成纖維細胞的抗黏附性能，并構建粘連松解術后再次粘連動物模型，在此基礎上評價mXG溫敏水凝膠對于粘連松解術后再粘連發生的預防效果及對轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達的影響，旨在為解決粘連松解術后再粘連這一臨床難題提供新的治療方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物、細胞和主要試劑健康雄性SD大鼠55只，由華北理工大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2004-0004。所有大鼠在溫度(22±2)℃、相對濕度(50±5)%環境下單籠飼養，期間提供充足的水和飼料，實驗前保證至少1周的適應性飼養，術前12 h禁食。帶有綠色熒光的L929鼠成纖維細胞(3T3 小鼠胚胎成纖維細胞)由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供。mXG溫敏水凝膠由天津大學化工學院合成，醫用殼聚糖防粘連膜粘停寧為煙臺萬利醫用品有限公司產品，TGF-β1和CTGF多克隆抗體為Affinity公司產品，免疫組織化學通用二抗PV6000為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，Van Gieson為珠海貝索生物技術有限公司產品，RPMI-1640和胎牛血清為美國Gibco公司產品。

1.2mXG溫敏水凝膠抗細胞黏附性能檢測將0.2 mL 4%mXG溶液加入48孔培養板中，移至37℃孵育1 h，使其完全凝膠。在每孔中加入1 mL含有10%FBS的RPMI-1640培養基，將含有綠色熒光標記的L929鼠成纖維細胞以1×104mL-1密度、在37℃、5%CO2的培養箱中培養。以直接在孔板中培養的細胞作為對照。培養48 h后，熒光顯微鏡下觀察凝膠表面細胞的數量和形態。

1.3大鼠腹壁-盲腸粘連松解術后再次粘連模型建立制作腹壁1 cm×2 cm大小、深約1 mm的創面；在與腹壁創面相對應的盲腸表面使用手術刷輕輕磨擦直到盲腸漿膜層被破壞至有明顯的點狀出血，將盲腸和腹壁表面懸吊縫合，使盲腸創面和腹壁創面相對合以確保粘連形成。術后7 d，鈍性分離粘連組織，創面摩擦處理至有明顯的滲血，連續縫合關腹。常規肌肉注射消炎藥。為了驗證模型的有效性，二次術后第7天處死大鼠，再次開腹驗證粘連松解術后再次粘連的情況。

1.4mXG水凝膠對粘連松解術后再次粘連效果的評價在一次損傷后發生粘連的大鼠中選擇48只粘連評分接近的實驗動物，對其實施粘連松解手術，隨機分為3組(n=16)：再粘連組、商業膜組和mXG水凝膠組。再粘連組在關腹前將1 mL生理鹽水注射于大鼠腹壁和盲腸的創面；商業膜組將2 cm× 3 cm大小的醫用殼聚糖防粘連膜粘停寧覆蓋于大鼠腹壁創面后關腹；mXG水凝膠組將1 mL 4% mXG溫敏水凝膠注射至大鼠腹壁和盲腸的創面，待凝膠完全形成后關腹。術后第7和14天分別處死各組大鼠8只，并按照以下評分標準對粘連程度進行評分[9]：0分，完全無粘連；1分，腹腔內有一處薄的粘連；2 分，有不止一處的疏松粘連；3 分，有比較致密的粘連；4 分，有不止一處的致密粘連；5 分，廣泛而致密的血管化粘連。對于粘連發生的區域，切取腹壁-盲腸粘連區域的組織；對于未粘連的區域，分別切取腹壁和盲腸的創面組織，固定、包埋，連續切片行HE染色、Van Gieson染色和免疫組織化學染色，觀察TGF-β1和CTGF表達情況， TGF-β1陽性細胞為細胞質或細胞核內出現棕黃或棕褐色顆粒，CTGF陽性細胞為細胞質內出現棕黃或棕褐色顆粒。

2　結　果

2.1mXG溫敏水凝膠內L929鼠成纖維細胞的粘附性能再粘連組中可見大量L929鼠成纖維細胞貼壁生長，呈細長的梭形并有偽足形成；在mXG溫敏水凝膠組mXG溫敏水凝膠表面僅有非常少的細胞，由于不能很好地貼壁，這些細胞大都呈圓球狀。見圖1(插頁一)。

2.2腹壁-腸壁粘連松解術后再次粘連的形態表現為了驗證模型的有效性，二次手術后第7天處死大鼠，再次開腹驗證粘連松解術后再次粘連的情況，所有經粘連松解術后再次損傷的大鼠腹壁與盲腸間均發生了嚴重的粘連，證明了腹壁-盲腸粘連松解術后再損傷粘連模型的有效性和穩定性。見圖2(插頁二)。

2.3再粘連術后粘連程度評分根據評分標準對各組大鼠術后粘連情況進行評分和統計，結果如表1所示。在再粘連組，術后第7天所有大鼠均發生了4～5分的嚴重粘連，第14天多數大鼠形成了5分粘連。在商業膜組，術后第7天時的粘連主要集中在3～4分，而在第14天時多數均形成4～5分的粘連，商業膜組粘連評分與再粘連組接近，但差異無統計學意義(P>0.05)。在mXG溫敏水凝膠組，多數大鼠均未發生粘連，少數幾只大鼠發生粘連，但僅是1分的輕度粘連；mXG溫敏水凝膠組粘連評分低于再粘連組(P<0.05)。

表1術后第7和14天各組大鼠損傷部位粘連評分

GroupAdhesionscore(t/d)　　714Adhesion4．25±0．464．88±0．35Commercial　membrane3．50±0．934．10±0．76mXGhydrogel0．13±0．35?△0．25±0．46?△

*P<0.05vsadhesion group;△P<0.05 compared with commerial membrane group.

2.4再粘連術后第7天組織病理學表現術后第7天的組織學結果顯示：再粘連組漿膜層連續性中斷，纖維結締組織增生情況嚴重，有大量中性粒細胞及巨噬細胞；商業膜組漿膜層連續，增生的結締組織厚度低于再粘連組，但膠原纖維較致密。mXG組盲腸和腹壁創面恢復平整，但纖維結締組織增生較多，且可見纖維組織中包裹著未降解的凝膠團。在再粘連組和商業膜組中，腹壁和盲腸間存在明顯的粘連區域(虛線內)，這一區域在Van Gieson特殊染色中被特異性地染成紅色。見圖3(插頁二)。

2.5再粘連術后第14天組織病理學表現術后第14天組織學結果顯示：再粘連組的粘連區域膠原纖維沉積明顯增多，粘連變得更為致密，部分區域可以觀察到有新生血管的出現，而且粘連區域的厚度相對于第7天時也有所增加；商業膜組粘連區域的厚度未見明顯增加，但粘連組織相對于第7天時變得更加規整和致密，而且部分區域有新生血管的出現；與第7天時比較，mXG溫敏水凝膠組第14天時腹壁創面組織中的炎性細胞明顯減少，未見凝膠的殘留，新生間皮層下原來存在的纖維蛋白沉積物在纖維蛋白溶解酶系統的作用下也逐漸地被降解和吸收，愈合后的組織變薄。盲腸的愈合情況與腹壁類似，但仍可見少量的纖維包裹的殘留凝膠。見圖4(插頁二)。

2.6再粘連術后TGF-β1和CTGF表達情況術后第7天，再粘連組與商業膜組在巨噬細胞、血管內皮細胞及鄰近的成纖維細胞中可見TGF-β1和CTGF呈強陽性表達；mXG組TGF-β1和CTGF陽性表達則較弱，陽性部位為組織內血管內皮細胞胞漿。術后第14天，再粘連組與商業膜組TGF-β1和CTGF表達呈彌漫陽性表達，主要在成纖維細胞和血管內皮細胞胞漿；mXG組細胞排列整齊，在結締組織內TGF-β1主要表達于成纖維細胞。各組TGF-β1和CTGF的表達情況與大體觀察、HE和Van Gieson染色結果一致。見圖5和6(插頁二)。

3　討　論

術后粘連是腹部手術引起的一種后遺癥，輕者影響腸道的運動功能，導致腹痛和腹脹等癥狀，重者出現腸梗阻乃至腸壞死。普通腹部外科手術后腹部粘連發生率為76%[10]。粘連松解術后再次粘連的情況不容忽視，然而對于預防粘連松解術后再次粘連的研究國內少有報道，作為這一研究的基礎，成功構建粘連松解術后再次粘連動物模型尤為重要。本研究實驗結果表明經粘連松解術后再次損傷的動物腹壁與盲腸間均發生了嚴重的粘連，建立了粘連松解術后再次粘連動物模型，在該模型有效性和穩定性的基礎上，研究和開發能夠有效預防粘連松解術后再次粘連的材料具有重要的臨床意義。

溫敏水凝膠由于兼具液態類材料的操作便利性和固態類材料的物理屏障性，并能結合微創療法，在術后防粘連領域得到了廣泛的關注。Yang等[11]新近報道一種新型光誘導亞胺交聯水凝膠—CNG hydrogel,該水凝膠便于術中操作使用，有很好的生物相容性，易于降解。Chen等[12]報道了含透明質酸與殼聚糖的可注射溫敏水凝膠，有良好的預防腹腔粘連的效果，但缺乏對粘連松解術后再次粘連的研究報道。因此研究和開發能夠有效預防粘連松解術后再次粘連的材料，具有重要的臨床意義。

本課題組前期利用綠色酶解反應制得了具有反向溫敏行為的mXG溫敏水凝膠，基于mXG的可注射性、良好的生物相容性及生物可降解性，首次將其應用于術后防粘連的研究中，在注射至腹壁和盲腸的創面后能夠快速地原位形成具有較高強度的凝膠，并且能夠在原位維持較好的完整性，所以其能夠在粘連形成的關鍵時期有效地將腹壁和盲腸的創面進行隔離，避免了創面的相互接觸而形成粘連，不僅提高了手術操作的便利性，而且在SD大鼠腹壁-盲腸損傷模型中取得了良好的預防術后粘連的效果[8]。

成纖維細胞和膠原纖維在創面的沉積是導致術后粘連形成的關鍵因素[13]。成纖維細胞在粘連的形成過程中起著非常重要的作用，因此如果能夠有效地阻抗成纖維細胞的黏附，則可以顯著地提升術后防粘連的效果。本研究將L929鼠成纖維細胞接種于mXG溫敏水凝膠表面，研究其在水凝膠表面的黏附行為。本實驗中抗細胞黏附性能研究結果顯示：相對于再粘連組大量L929鼠成纖維細胞貼壁梭形生長，伴偽足的形成，mXG溫敏水凝膠表面僅有非常少的細胞，呈圓球狀，表明mXG溫敏水凝膠具有很好的抗成纖維細胞黏附性能。鑒于mXG溫敏水凝膠有較高的凝膠強度，在有效發揮物理隔離作用的同時，還能夠明顯阻抗成纖維細胞的黏附，本文作者預測mXG溫敏水凝膠能更好地預防粘連松解術后再次粘連的發生。

本實驗中大體觀察和粘連程度評分結果顯示：再粘連組均發生了嚴重的粘連，粘連評分均在4～5分，組織病理學觀察可見粘連部分有大量膠原纖維存在，且有新生血管出現，這表明粘連松解術后再次粘連實驗動物模型構建成功。商業膜組大鼠均發生粘連，粘連情況接近再粘連組，但粘連評分結果略低于再粘連組，組織病理學觀察可見粘連區域厚度并未隨著時間的延長而增厚，但粘連部分區域有新生血管生成，可見商業膜對粘連松解術后再次粘連的預防效果甚微。mXG溫敏水凝膠組中僅有2只大鼠發生輕微粘連，粘連評分在0～1分，其余均未發生粘連，隨著時間的延長損傷部位炎性細胞逐漸減少，凝膠逐漸降解，組織逐漸愈合變薄。mXG溫敏水凝膠具有優異的溫敏性，在注射至腹壁和盲腸的創面后能夠快速地原位形成具有較高強度的凝膠，起到很好的物理覆蓋作用，并且mXG溫敏水凝膠降解過程中也能夠在原位維持較好的完整性。mXG溫敏水凝膠在大鼠腹壁-盲腸粘連松解術后二次損傷粘連模型中能夠有效地預防粘連的發生。

術后粘連形成的過程非常復雜,其中涉及各種生長因子和細胞因子的參與，根據其功能可分為抗粘連細胞因子和促粘連細胞因子兩類，大量文獻[14-15]表明TGF-β1和CTGF在腹腔粘連的發生發展中起到了重要的作用。

目前公認TGF-β在腹膜粘連形成過程中發揮關鍵作用，以TGF-β1作用最強[16]，TGF-β1通過自分泌和旁分泌機制激活成纖維細胞產生膠原，阻斷纖維蛋白溶解酶原激活物，增加血管形成和趨化成纖維細胞、單核細胞及巨噬細胞，破壞纖維蛋白溶解與合成平衡，導致細胞外基質沉積而有助于粘連的形成，阻斷其作用已證實可達到預防腹膜粘連形成的效果[17]。

CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，可由成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞合成分泌。近年研究[18-19]顯示：CTGF是介導TGF-β1促纖維化作用的一個重要的下游因子。Thaler等[18]發現：模型大鼠術后腹腔粘連組織中 CTGF水平高于正常對照組，其高峰出現在術后第6～15天，CTGF水平隨著粘連組織中膠原的表達而變化，故認為CTGF與腹膜粘連形成有重要的關系。本研究結果顯示：對照組術后第7和14天均可見TGF-β1和CTGF高表達，商業膜組早期起到一定的物理隔離作用，防粘連膜雖然在使用前為固態膜，但是植入體內后在創面滲血和腹腔液的作用下會很快變為黏稠的溶液狀態，難以長時間地存留于創面，因而不能在粘連形成的關鍵時期起到有效的物理阻隔作用，所以在纖維蛋白原滲出的基礎上，有不同程度的CTGF表達。mXG溫敏水凝膠可以完全覆蓋在傷口表面，并且有較高的凝膠強度，一方面在術后早期起到隔離作用，阻止纖維蛋白原的滲出；另一方面mXG溫敏水凝膠有很好的生物相容性和可降解性，不會對機體產生不良影響，所以在術后第7和14天TGF-β1和CTGF只有弱陽性表達，這與HE和Van Gieson染色結果一致，表明mXG溫敏水凝膠可以有效預防粘連松解術后再次粘連的發生。

本實驗結果顯示：采用大鼠構建粘連松解術后再次粘連動物模型成功率高。本實驗成功復制了臨床上比較復雜的粘連松解術后再次粘連病癥模型，并且證實mXG溫敏水凝膠具有很好的預防粘連松解術后再次粘連的效果，為今后研究腹腔術后粘連奠定了良好的實驗基礎，也為解決粘連松解術后再粘連這一臨床難題提供了新的治療方法。

[參考文獻]

[1] Diamond MP,Wexner SD,diZereg GS,et al.Adhesion prevention and reduction: current status and future recommendations of a multinational interdisciplinary consensus conference[J].Surg Innov,2010,17(3):183-188.

[2] Brochhausen C,Schmitt VH,Planck CN,et al.Current strategies and future perspectives for intraperitoneal adhesion prevention[J].J Gastrointest Surg,2012,16 (6):1256-1274.

[3] Ward BC,Panitch A.Abdominal adhesions: current and novel therapies[J].J Surg Res,2011,165:91-111.

[4] 劉國輝,李有柱,趙軍.羧甲基纖維素鈉在預防術后腹膜粘連中的作用[J].吉林大學學報:醫學版,2002,28(2):163-164.

[5] Yang B,Gong C,Zhao X,et al.Preventing postoperative abdominal adhesions in a rat model with PEG-PCL-PEG hydrogel[J].Int J Nanomed,2012,7:547-557.

[6] Gao X,Deng X,Wei X,et al.Novel thermosensitive hydrogel for preventingformation of abdominal adhesions[J].Int J Nanomed,2013,8:2453-2463.

[7] Wu Q,Wang N,He T,et al.Thermosensitive hydrogel containing dexamethasone micelles for preventing postsurgical adhesion in a repeated-injury model[J].Sci Rep,2015,5:13553.

[8] Zhang E,Li J,Zhou Y,et al.Biodegradable and injectable thermoreversible xyloglucan based hydrogel for prevention of postoperative adhesion[J].Acta Biomater,2017,55:420-433.

[9] Nair SK,Bhat IK,Aurora AL.Role of proteolytic enzyme in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions[J].Arch Surg,1974,108(6):849-853.

[10]Okabayashi K,Ashrafian H,Zacharakis E,et al.Adhesions after abdominal surgery: a systematic review of the incidence,distribution and severity[J].Surg Today,2014,44(3):405-420.

[11]Yang Y,Liu X,Li Y,et al.A postoperative anti-adhesion barrier based on photoinduced imine-crosslinking hydrogel with tissue-adhesive ability[J].Acta Biomater,2017,62:199-209.

[12]Chen CH,Chen SH,Mao SH,et al.Injectable thermosensitive hydrogel containing hyaluronic acid and chitosan as a barrier for prevention of postoperative peritoneal adhesion[J].Carbohydr Polym,2017,173:721-731.

[13]Bae SH,Son SR,Kumar Sakar S,et al.Evaluation of the potential anti-adhesion effect of the PVA/Gelatin membrane[J].J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater,2014,102(4):840-849.

[14]Wei G,Chen X,Wang G,et al.Effect of resveratrol on the prevention of intra-abdominal adhesion formation in a rat model[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(1):33-46.

[15]Zhang H,Song Y,Li Z,et al.Evaluation of ligustrazine on the prevention of experimentally induced abdominal adhesions in rats[J].Int J Surg,2015,211(6):115-121.

[16]Zhang H,Song Y,Li Z,et al.Evaluation of breviscapine on prevention of experimentally induced abdominal adhesions in rats[J].Am J Surg,2016,211(6):1143-1152.

[17]Yigitler C,Karakas DO,Kucukodaci Z,et al.Adhesion-preventing properties of 4% icodextrin and canola oil: a comparative experimental study[J].Clinics,2012,67(11):1303-1308.

[18]Thaler K,Mack JA,Berho M,et al.Coincidence of connective tissue growth factor expression with fibrosis and angiogenesis in postoperative peritoneal adhesion formation[J].Eur Surg Res,2005,37(4):235-241.

[19]Ryan CK,Sax HC.Evaluation of a carboxymethylcellulose sponge for prevention of postoperative adhesions[J].Am J Surg,1995,169(1):154-159.