Wnt5a對人肺腺癌A549細胞凋亡的調控作用及其機制

楊　易,包康達,周彥兵,袁　超,李　勇,劉曉明,徐金瑞

(寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

肺癌是全球發病率和死亡率最高的一類癌癥[1-3]。肺腺癌占非小細胞肺癌(NSCLC)的50%，其主要特征是無限增殖，因此抑制肺癌細胞增殖、誘導其凋亡是治療肺癌的主要策略[4-5]。Wnt5a是一種旁分泌、自分泌型糖蛋白，Wnt5a配體與細胞跨膜受體結合，可將信號傳遞至細胞內，進而產生一系列反應。研究[6-8]顯示：Wnt5a參與不同腫瘤細胞的發生發展。Wnt5a可介導不同受體參與調節不同Wnt信號轉導通路，并最終導致不同的結果。目前尚未見有關Wnt5a信號調控人肺腺癌細胞作用的文獻報道，因此本研究探討Wnt5a對人肺腺癌細胞A549凋亡的作用并闡明其機制，旨在為深入研究靶向抑制藥物和肺腺癌治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1細胞來源小鼠Wnt 5a過表達細胞系(L Wnt-5a ATCC○RCRL-2814TM)和對照細胞系(L Cell ATCC○RCRL-2648TM)來源于ATCC細胞庫，人肺腺癌A549細胞來源于中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器RPMI-1640培養基(Gibco 公司，美國)，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(BD 公司，美國)，線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天公司，中國)，活性氧(ROS)檢測試劑盒(Sigma 公司，美國)，TUNEL原位末端凋亡檢測試劑盒(Roch公司，德國)，反轉錄試劑盒和qPCR檢測試劑盒和羊抗兔IgG-HRP(全式金公司，中國)。Wnt5a、C-Capase3 和C-PARP1(CST公司，美國)，Bcl-2、Bax、AIF、Mcl-1和CtyoC(Proteintech公司，美國)，胎牛血清(Thermo公司，美國)，青霉素和鏈霉素(Hyclone公司，美國)。CyFlow○RCube流式細胞儀(Partec公司，德國)，iQ5熒光定量PCR儀和BioRAD凝膠成像系統(BioRAD公司，美國)。

1.3Wnt5a和C條件培養液制備和細胞培養參考文獻[9] 的方法制備Wnt5a和C條件培養液(Wnt5a條件培養液富含Wnt5a蛋白，而C條件培養液中檢測不到Wnt5a蛋白表達)，-20℃保存備用，使用時按1∶1加入新鮮培養液用于細胞培養。A549細胞培養于含 10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中培養，每 2～3 d 傳代1次。

1.4Wnt5a蛋白表達檢測將收集的C和 Wnt5a條件培養液離心取上清，定量后煮沸，蛋白上樣量為30 μg。經SDS-PAGE后，濕轉至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBS室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，4℃過夜孵育Wnt5a一抗，TBST洗滌3次，加羊抗兔IgG-HRP，繼續室溫孵育1.5 h后TBST洗滌3次，顯影和定影，X 光片顯色，檢測Wnt5a蛋白表達情況。

1.5Wnt5a mRNA表達檢測A549細胞以3×105mL-1接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h，對照組和實驗組分別加入C和Wnt5a培養液，培養24 h后，收集細胞，Trizol法提取總RNA，采用RT-PCR法檢測Wnt5a mRNA表達。反應體系為20 μL，β-actin mRNA退火溫度為58℃，F:5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′，R:5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′；Wnt5a mRNA退火溫度為60℃，F: 5′-ACTGTGCCACTTGTATCAGG-3′，R: 5′-CTTCGATGTC-

GGAATTGATA-3′。

1.6A549細胞形態學檢測以3×105mL-1細胞密度將A549細胞接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h，分別加入Wnt5a(實驗組)和C(對照組)條件培養液培養24 h后，采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態并記錄拍照。

1.7A549細胞凋亡率檢測以3×105mL-1細胞密度將A549細胞接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h，C培養液培養2 h作為對照組，處理組Wnt5a條件培養液培養2、4、12、24和48 h后，離心收集細胞，按說明書方法檢測細胞凋亡率，獨立重復3次實驗。

1.8A549細胞中ROS水平檢測以3×105mL-1細胞密度將A549細胞接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h， C培養液培養2 h作為對照組，同時處理組Wnt5a條件培養液培養2、12、24和48 h后，離心收集細胞，吸棄培養液，用PBS緩沖液沖洗2次，按說明書方法采用流式細胞術檢測ROS水平，獨立重復3次實驗。

1.9線粒體膜電位檢測以3× 105mL-1細胞密度將A549細胞接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h， C培養液培養2 h作為對照組，同時處理組Wnt5a條件培養液培養2、12、24和48 h，按說明書方法采用用流式細胞術檢測線粒體膜電位。

1.10Western blotting法檢測蛋白表達A549細胞以3×105mL-1細胞密度接種于6孔板培養皿中，待細胞貼壁6～8 h，依次加入C和Wnt5a條件培養液，培養 24 h 后，按照全蛋白提取試劑盒說明提取各組全蛋白，并參考BCA蛋白檢測試劑盒說明進行定量。SDS-PAGE電泳后，濕轉至PVDF膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉2 h，加入特異性一抗于4℃過夜孵育，次日平衡至室溫，TBST漂洗(酶標二抗) ，室溫孵育1.5 h；TBST洗滌3次，用Western Enhance Bright ECL底物顯色，BioRAD成像系統曝光。

2　結　果

2.1Wnt5a條件培養液中Wnt5a蛋白的表達Wnt5a處理組能檢測到Wnt5a蛋白的表達，而對照組未檢測到Wnt5a蛋白表達。見圖1。

圖1　2組條件培養基中Wnt5a蛋白表達

Fig.1Expressions of Wnt5a protein in conditioned mediums in two groups

2.2 2組A549細胞中Wnt5a mRNA表達實時熒光定量PCR結果顯示：Wnt5a處理12 h組和24 h組Wnt5a mRNA表達水平高于對照組，其中24 h組高出對照組6倍(P<0.05)，且Wnt5a的刺激呈現時間依賴性。見圖2。

2.32組A549細胞形態學對照組未見TUNEL陽性細胞，經DAPI染色，核呈圓形或卵圓形，且大小均一。Wnt5a處理組能觀察到一定數量的TUNEL染色細胞，但與DNAase陽性處理組比較，TUNEL染色細胞明顯減少。見圖3(插頁三)。

*P<0.05 compared with control group.

Fig.2Expression levels of Wnt5a mRNA in A549 cells in two groups

2.4 2組A549細胞凋亡率在雙變量流式細胞術檢測散點圖中可見：細胞分落在4個象限：左下(LL)象限、右下(LR)象限、右上(UR)象限和左上(UL)象限，其中AV陽性細胞(右上和右下象限)為凋亡細胞，PI染色單陽細胞(左上象限)為壞死細胞。Wnt5a處理A549細胞后隨時間的延長，細胞凋亡率呈現增加的趨勢；與對照組比較，處理12、24和48 h時，Wnt5a處理組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；處理2和4 h時與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4和表1。

A:Control group;B-F:Treatment group(2,4,12,24， and 48 h).

GroupApototicrate(η/%)ROSMitochondrialmembranepotentialControl3．70±1．3339．30±1．210．008±0．001Treatment(t/h)24．02±0．4940．72±2．890．013±0．00345．54±1．13-0．036±0．0016--0．078±0．0011212．00±1．111606．51±43．590．097±0．0022410．25±1．56380．77±31．860．117±0．0014812．03±0．431557．51±47．30-

“-”:No data.

2.5 2組A549細胞中ROS水平流式細胞術檢測結果顯示：Wnt5a組A549細胞中ROS水平高于對照組，但是Wnt5a處理不同時間產生的ROS水平不同。Wnt5a處理12 h時處理組A549細胞產生的ROS水平最高(Geo mean值=1 605.51)，24 h時Wnt5a處理組ROS水平下降(Geo mean值=263.77)，48 h時處理組ROS水平又回升但未超過12 h時(Geo mean值=1 557.51)。見圖5和表1。

2.62組A549細胞線粒體膜電位與對照組比較，處理組 A549細胞線粒體膜電位明顯降低(P<0.01) 。見圖6和表1。

A:Control group;B-E:Treatment group(2,12,24,and 48 h).

A:Control group;B-F:Treatment group(2,4,6,12, and 24 h).

2.72組A549細胞中凋亡相關蛋白表達Western blotting法檢測結果顯示：Wnt5a處理組凋亡相關蛋白Bcl-2家族的促凋亡蛋白BAX表達量明顯高于對照組，AIF蛋白表達量明顯下調，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1 表達量與對照組比較無明顯變化(P>0.05)。見圖7。

3　討　論

NSCLC占肺癌的85%，大多數NSCLC就診時已處于ⅢB期或Ⅳ期，失去根治的機會，只能通過化療方法緩解癥狀、延長生存。但化療毒副作用大，尋找有效的分子靶向治療是目前腫瘤專家和科研工作者共同關注的焦點。目前已有針對Wnt信號通路的抑制劑被用于抑制腫瘤細胞增長，Wu等[10]證實抑制劑XAV939可以抑制Wnt信號通路進而抑制結腸癌細胞的生長。Jia等[11]研究發現：DKK1表達水平直接反映了胃癌發展進程，miR-493介導的DKK1下調了胃癌細胞的增殖侵襲。Vuga等[12]研究發現：Wnt5a基因在普通間質性肺炎中高表達，在正常的肺成纖維細胞中Wnt5a能明顯促進細胞增殖，并抑制由H202誘導的凋亡。Zhang等[13]研究發現：牛皮癬患者高表達Wnt5a 基因；在HaCaT和NHK細胞中采用Knockdown法降低Wnt5a表達后，抑制了細胞增殖且誘導細胞凋亡發生。Yao等[14]研究發現NSCLC患者Wnt5a高表達預示預后不良。

圖7　2組A549細胞中凋亡相關蛋白表達

Fig.7Expressions of apoptosis-related proteins in A549 cells in two groups

本研究結果顯示：與對照組比較，Wnt5a處理組早期凋亡小體明顯增多，利用AV/PI雙染流式術檢測Wnt5a組凋亡率較對照組有增高趨勢，隨處理時間延長細胞凋亡率明顯升高，Wnt5a組A549細胞中ROS水平高于對照組，差異有統計學意義，尤其是12和48 h時。Wnt5a處理組線粒體膜電位低于對照組，且隨處理時間延長膜電位下降更明顯。促凋亡蛋白Bax在Wnt5a處理組高表達，活化的Caspase3蛋白亦為高表達。

本實驗結果表明：Wnt5a可導致人肺腺癌A549細胞線粒體膜破壞，JC-1不能聚集到線粒體內，而是以單體的形式游離在細胞質內，使R3 熒光強度增強，因此 JC-1 單體與多聚體的比值高于對照組，且隨Wnt5a處理時間延長而表現為線粒體膜電位降低更明顯。由此可見，Wnt5a是通過降低線粒體膜電位來誘導細胞的凋亡。Wnt5a通過降低抗凋亡蛋白的表達水平，提高促凋亡蛋白的含量使線粒體膜孔打開，活化的Caspase3蛋白表達上調，活化的PRAP1蛋白表達上調，積累放大使細胞色素C(CytoC)進入細胞，故檢測到CytoC蛋白表達上調，從而引發細胞凋亡發生。

綜上所述，Wnt5a可以成為肺腺癌的分子靶向基因之一，通過激活Wnt5a誘導癌細胞凋亡，從而達到治療肺腺癌的作用。本實驗結果為進一步研究治療肺腺癌提供了理論依據。

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