葉酸-聚乙烯亞胺復合碳點的跨膜機制和胞內分布

劉　杰，布文奐，趙　歡，李　杏，孟　琳，董　悅，孫宏晨

(1.吉林省口腔科學與技術納米工程重點實驗室，吉林 長春 130021;2.吉林大學口腔醫院口腔病理科，吉林長春 130021;3.佳木斯大學口腔醫院正畸科，黑龍江 佳木斯 154007)

碳點(carbon dots, CDs)是一種新型的納米材料，具有尺寸較小、比表面積較大、表面活性良好和生物毒性較低等優點，被越來越廣泛地應用到生物醫學領域。許多碳點具有光致發光的特點，可被用于生物傳感和生物成像中[1]。在轉基因治療領域，碳點作為一種非病毒載體，不易與染色體整合，免疫反應少，易于制備，還具有細胞成像的功能，與病毒載體相比具有諸多優勢[2]。目前針對納米材料跨膜轉運和胞內分布的研究[3-4]較多，但是對碳點跨成骨細胞膜轉運的機制和胞內分布的研究尚未見報道，這可能是碳點作為一種基因載體在骨缺損治療中應用的難點[5]。本實驗以葉酸和聚乙烯亞胺(polyethelenimice,PEI)為原料，通過一步完成的水熱法合成熒光碳點，闡明碳點進入小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1的方式以及在細胞內的分布，為碳點作為一種非病毒載體在轉基因治療中的應用提供實踐基礎。

1　材料與方法

1.1細胞系、主要試劑和儀器小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1(Gibco公司，美國)。高糖DMEM培養基粉、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素溶液(Gibco公司，美國)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胰蛋白酶粉劑、MTT粉劑、活性氧(ROS)染劑、葉酸和PEI(相對分子質量為1 800)(Sigma-Aldrich公司，美國)，細胞器染劑和細胞凋亡試劑盒(Invitrogen公司，美國)，細胞周期試劑盒(七海生物公司，中國)。倒置熒光顯微鏡及照相系統(Olympus公司，日本)，酶標儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學技術有限公司)。

1.2細胞培養MC3T3-E1細胞系培養在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養基中，在溫度為37℃、5%CO2條件下培養，每2～3 d培養基換液。

1.3碳點制備稱取2 g葉酸溶于20 mL去離子水中，滴加1 mol·L-1的NaOH助溶，隨后向澄清的黃色溶液中加入3 mL的PEI(相對分子質量為1 800)，于200℃無氧條件下反應5 h，冷卻至室溫后3 000 r·min-1離心30 min，去上清，用0.22 μm的濾器抽濾去除較大的顆粒，隨后滲析3 d，每12～24 h換水，凍干后即可獲得粉末狀的葉酸-PEI復合碳點。

1.4MTT法檢測細胞增殖率將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔4 000個細胞的密度接種到96孔板內，在37℃、5%CO2孵箱內孵育24 h。然后換液使培養基中碳點的濃度為0、50、100、150、200、250、300、350、400和450 mg·L-1，每個劑量設置6個復孔，同時設置調零孔以減少誤差。分別培養24和48 h后在各孔加入20 μL的MTT液(5 000 mg·L-1)，37℃孵育4 h后棄去培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)并在搖床上混勻，酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)值，并按照公式計算細胞增殖率。細胞增殖率=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.5流式細胞術檢測細胞周期將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種至6孔板內，在37℃、5%CO2孵箱內孵育24 h。換液使碳點組碳點的濃度為100 mg·L-1，實驗組和空白對照組各有3個復孔。24 h后胰酶消化并離心，PBS沖洗2次后用70%乙醇在4℃固定2 h以上，用含碘化丙啶和RNase A的染液37℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測(激發波長488 nm，檢測紅色熒光)，以處于各周期細胞數占總細胞數的百分比來表示結果。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種至6孔板內，在37℃、5%CO2孵箱內孵育24 h。將MC3T3-E1細胞系分為空白對照組、葉酸組和碳點組。換液使碳點組碳點的濃度為100 mg·L-1，實驗組和空白對照組各有3個復孔，同時設置3個其他的孔來幫助流式設門。24 h后胰酶消化并離心(使用原來含血清的培養基終止胰酶消化以保留培養基中未貼壁的細胞)，PBS沖洗后使用碘化丙啶和Annexin Ⅴ-FITC對細胞進行染色，30 min內流式細胞儀檢測，Annexin Ⅴ-FITC為綠色熒光，碘化丙啶為紅色熒光。以正常細胞、壞死細胞、早期凋亡和晚期凋亡細胞數占總細胞數的百分構成比來表示。

1.7流式細胞術檢測細胞ROS水平將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種至6孔板內，在37℃、5%CO2的孵箱內孵育24 h。換液使葉酸組和碳點組濃度均為100 mg·L-1，各組均設有3個復孔，同時設置1個未染色的孔來消除細胞背底熒光的干擾，染色后上流式細胞儀通過FITC通道來檢測熒光強度。以葉酸組和碳點組熒光強度與空白對照組熒光強度的比值來表示細胞ROS水平。

1.8顯微細胞成像將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種至放置有蓋玻片的6孔板內，在37℃、5%CO2的孵箱內孵育24 h。換液使碳點的終濃度為100 mg·L-1，在37℃、5%CO2的孵箱里再繼續孵育4 h， PBS沖洗后用4%甲醛37℃固定15 min，應用倒置熒光顯微鏡使用紫外光激發進行觀察和拍照。統一碳點的濃度為80 mg·L-1，各組分別共孵育0、15、30、60、120和240 min后用PBS沖洗，并用4%甲醛37℃固定15 min，應用倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.9檢測碳點內吞的途徑將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種到放置有蓋玻片的6孔板內，在37℃、5%CO2孵箱內孵育24 h。設置陰性對照組(無碳點)和空白對照組(100 mg·L-1的碳點)，每組3個復孔，同時利用制霉菌素抑制胞膜窖途徑[6]和諾考達唑抑制巨胞飲作用[7]，4℃孵育來抑制能量依賴性的內吞作用，無血清條件下預處理45 min后加入碳點和血清使碳點終濃度為100 mg·L-1，再孵育1 h后胰酶消化、離心重懸并上流式細胞儀檢測藍色熒光強度。以碳點加各種抑制劑組碳點的細胞攝取率與空白對照組碳點的細胞攝取率的比值來表示結果。

1.10檢測碳點在細胞內的定位將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個細胞的密度接種到放置有蓋玻片的6孔板內，在37℃、5%CO2孵箱內孵育24 h。換液使碳點終濃度為100 mg·L-1，共孵育1 h后換液，然后對各細胞器進行染色。內質網在37℃染色30 min后在37℃、4%甲醛中固定2 min；線粒體在37℃染色30 min后在37℃、4%甲醛中固定15 min；溶酶體在37℃染色60 min后在37℃固定15 min；高爾基體在37℃、5%CO2孵箱孵育過夜染色(≥16 h)后于室溫用4%甲醛固定30 min。PBS沖洗后上熒光倒置顯微鏡觀察拍照，藍色熒光的是碳點，紅色熒光表示各細胞器，紫色熒光表示碳點分布至相應細胞器上。

2　結　果

2.1碳點的細胞毒性和細胞增殖率在MTT實驗中，與空白對照組比較，不同濃度碳點組在24 h時未表現出細胞毒性，100～450 mg·L-1碳點組細胞增殖率差異均有統計學意義(P<0.05)；當碳點濃度達到450 mg·L-1時，細胞增殖率仍高于空白對照組(P<0.05)；在48 h時間點時，隨著碳點濃度的增加，細胞增殖率先增高后降低，當碳點濃度達到350 mg·L-1時，細胞增殖率僅有空白對照組的68.4%(P<0.05)，表現出明顯的細胞毒性。細胞周期檢測結果顯示：與空白對照組比較，100 mg·L-1碳點組細胞共孵育后24 h細胞從G0期和G1期向S期轉變增加，并且G2期和M期細胞比例也升高。見表1和2。

表1各組MC3T3-E1細胞增殖率

GroupProliferationrate(t/h)　2448Blankcontrol100．00±9．28100．00±7．36CDs(mg·L-1)　50107．16±3．56117．84±0．75?　100123．78±2．09?171．37±4．81?　150134．10±9．31?146．86±9．19?　200149．86±13．89?146．08±6．53?　250163．61±17．74?112．94±9．04　300143．27±12．24?92．16±10．44　350126．65±6．91?68．63±12．64?　400120．63±4．71?68．14±23．84?　450122．92±2．87?67．55±4．20?

*P<0.05 compared with blank control group.

表2各組MC3T3-E1細胞在不同細胞周期的百分比

GroupPercentageofcellsG0andG1phaseSphaseG2andMphaseBlankcontrol44．25±0．6039．62±0．5114．60±0．35CDs41．82±1．40?41．07±0．45?15．54±1．10

*P<0.05 compared with blank control group.

2.2熒光碳點的顯微細胞成像碳點被紫外光激發可以發射藍色熒光，因此可被用于細胞成像，并且在相同的曝光時間內藍色熒光的熒光強度越高，表示有越多的碳點被細胞攝取。碳點被細胞攝取后主要分布在細胞質中，能夠較好地顯示細胞的形態。見圖1(插頁四)。

2.3細胞攝取碳點的途徑抑制劑實驗結果顯示：陰性對照組無碳點，因此幾乎檢測不到熒光，攝取率幾乎為0；空白對照組有碳點但未應用抑制劑，相對攝取率為100%；當采用胞膜窖的抑制劑制霉菌素作用于細胞時，與空白對照組比較，制霉菌素組細胞攝取碳點量減少(P<0.05)；當用巨胞飲的抑制劑諾考達唑抑制巨胞飲途徑時，細胞攝取碳點的量也減少，但差異無統計學意義(P>0.05)；當將細胞置于4℃以抑制能量依賴性的內吞途徑時，與空白對照組比較，細胞攝取碳點量明顯減少(P<0.05)，但尚有碳點能夠被細胞攝取。各組MC3T3-E1細胞攝取碳點的定量分析結果見圖2。

圖2　各組MC3T3-E1細胞攝取碳點的定量分析

Fig.2Quantitative analysis of CDs uptaken in MC3T3-E1 cells in various groups

2.4碳點在細胞內的分布碳點被紫外光激發可以發射藍色熒光，各細胞器的染色劑在綠光激發下可以發射紅色熒光，當藍色熒光與紅色熒光重疊產生紫色熒光時，可以說明碳點在細胞器上分布的情況[8-10]。倒置熒光顯微鏡下觀察：碳點的藍色熒光與線粒體的紅色熒光較好重疊，提示碳點能夠在線粒體上較多地分布；碳點的藍色熒光與溶酶體的紅色熒光較好重疊，提示碳點能夠在溶酶體上較多地分布；碳點的藍色熒光與內質網的紅色熒光不完全重疊，提示碳點能夠在內質網上分布；碳點的藍色熒光與高爾基體的紅色熒光重疊得較差，提示碳點在高爾基體上分布較少或者細胞內高爾基體的數量較少。見圖3(插頁四)。

2.5各組MC3T3-E1細胞凋亡率空白對照組細胞構成比：正常細胞98.45%，早期凋亡細胞0.53%，晚期凋亡細胞0.37%，壞死細胞0.65%；葉酸組細胞構成比：正常細胞98.07%，早期凋亡細胞0.73%，晚期凋亡細胞0.41%，壞死細胞0.79%；碳點組細胞構成比：正常細胞98.52%，早期凋亡細胞0.37%，晚期凋亡細胞0.33%，壞死細胞0.77%。與空白對照組比較， 葉酸組和碳點組MC3T3-E1細胞凋亡構成比無明顯變化。見圖4。

A：Control group; B: Folic acid group; C: CDs group.

2.6各組細胞中ROS水平與空白對照組(100%)比較，葉酸組和碳點組細胞中ROS水平明顯降低(P<0.05)。葉酸組細胞中ROS水平下降到空白對照組的60.05%，碳點組細胞中ROS水平下降到空白對照組的42.78%。

3　討　論

創傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術清創以及各種先天性疾病導致的骨缺損是臨床上常見的問題[11]，傳統療法存在諸多不足，因此尋找一種新型有效的治療方法非常必要[12]。轉基因方法治療骨缺損是當前研究熱點，其中miRNAs對細胞增生、分化、凋亡和代謝均具有顯著影響[13-14]。單純基因不穩定，極易被細胞內酶降解，因此需要良好的基因載體保護基因到達相應位置來發揮其功能。病毒作為傳統的基因載體，在多種細胞中顯示了較高轉染效率。然而，病毒存在的毒性和免疫原性等問題限制了其在轉基因治療中的應用。碳點作為一種非病毒載體，表面具有多種功能基團，易于修飾，可以通過不同的功能化改變其表面電荷，使其帶有正電，有利于結合帶負電的基因，保護基因不被降解，同時也有助于與帶負電的細胞膜表面結合，促進治療基因進入細胞[15]。碳點攜帶促成骨基因用于骨損傷治療，可以保護基因不被生物系統中的酶降解、避免病毒引起的免疫原性，增強治療效果。

作為一種基因載體，碳點跨細胞膜轉運的途徑和胞內分布對基因在細胞內的轉歸有著十分重要的意義[10]。目前關于納米粒子跨膜機制和胞內轉運的研究較多。細胞攝取納米粒子的途徑較多，但都是基于細胞膜內陷形成的細胞內囊泡而實現的。細胞通過形成的囊泡來包繞納米粒子，進而將其轉運到細胞內，這種能量依賴性的內吞途徑主要包括吞噬作用、網格蛋白介導的胞飲作用、小窩蛋白介導的胞飲作用(胞膜窖)和巨胞飲作用[16-17]。細胞內常見的細胞器有內質網、線粒體、溶酶體和高爾基體，不同的細胞器在細胞的代謝以及發揮生物功能中發揮著不同的作用。因此，明確碳點內吞的途徑以及其在細胞內的轉運方式，對了解碳點作為一種基因載體在細胞內發揮的作用具有重要的意義。但是碳點作為一種新型的納米粒子，目前少有這方面內容的報道。

本研究以葉酸和PEI為原料，通過水熱法合成的碳點能夠在紫外光激發下發射藍色熒光，并能進入細胞進行細胞成像。碳點對細胞的毒性較小，在低濃度時具有一定的促進細胞增殖的作用，濃度較高時則能抑制細胞的增殖。此外碳點對細胞的凋亡無影響，還能顯著降低細胞中ROS水平。碳點能夠通過胞膜窖途徑和非能量依賴性途徑內吞進入細胞，然后分布到內質網、高爾基體、溶酶體和線粒體這些細胞器上去。

綜上所述，本研究中的碳點生物相容性較好，不良反應少，能通過多種途徑有效地進入細胞，并能分布至各個細胞器上，為所載基因在細胞內發揮生物學功能提供了理論基礎。碳點有潛力成為一種性能優良的基因載體來應用于轉基因治療。

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