MicroRNA-210對卵巢癌細胞生長及放射敏感性的影響

鐘莉莉，趙銀龍，李炳錦，鄒曉晗，程子倩，崔然吉

(1.吉林大學第二醫院研究中心 吉林省重大疾病分子與化學遺傳學重點實驗室，吉林 長春 130041；2.吉林大學第二醫院核醫學科，吉林 長春 130041)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其發病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌，居婦科惡性腫瘤的第3位，但其病死率卻高居婦科腫瘤的首位[1-2]。放射治療是卵巢癌治療中常用的一種局部治療手段，特別是在晚期卵巢癌治療中起著越來越重要的作用，其機制是通過放射線的電離作用抑制和殺滅腫瘤細胞[3]。但在實際治療過程中，經常遇到輻射不敏感或輻射抵抗的現象[4]，其機制尚不完全明確。

MicroRNA(miRNA)是一組由內源基因編碼的長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[5]。近年來研究[6-7]表明: miRNA表達水平與腫瘤的形成、腫瘤細胞的增殖和治療均有著密切的聯系。與其他類型腫瘤一樣，卵巢癌miRNA表達也有其特殊的異常，已有研究[8-9]顯示：miR-16、 miR-96、 miR-141和miR-200等miRNA在卵巢癌組織中異常高表達, miR-140、miR-145和miR-199a等miRNA在卵巢癌組織中異常低表達，與卵巢癌細胞的發生發展有關；另有研究[10]顯示：miR-210與卵巢癌的化療耐藥有關，但miR-210與卵巢癌細胞的生長和放射治療的關聯性目前尚無相關報道。本研究探討miR-210對卵巢癌細胞生長的影響及其與放射治療敏感性的關系，并進一步闡明miR-210在卵巢癌發展和治療中的作用及其可能的分子機制，為卵巢癌的放射治療提出新的觀點，為臨床卵巢癌早期診斷、治療效果預測提供可能的理論依據。

1　材料與方法

1.1細胞株﹑主要試劑與儀器人卵巢癌細胞株OVCAR3和SKOV3購于美國ATCC細胞庫。細胞培養用的RPMI-1640培養基﹑胎牛血清、青鏈霉素抗生素試劑和胰蛋白酶，miR-210 mimic、anti-miR-210抑制劑，Lipofectamine 2000，BCA Protein Assay Kit，TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒和Super Singal West Dura發光試劑盒(美國 Invitrogen公司)；MTT和DMSO(美國 Amresco公司)；一抗和二抗(美國CST公司)。細胞培養箱﹑PCR儀和酶聯免疫檢測儀(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，核酸電泳儀和凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)，細胞照射設備(美國Varian 23Ex醫用高能電子直線加速器)。

1.2細胞培養卵巢癌細胞株培養于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養基中，放置于37℃、5%CO2細胞培養箱中靜置培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長融合達80%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶3),用于后續實驗。

1.3構建過表達miR-210和低表達miR-210的卵巢癌細胞株采用Lipofectamine 2000轉染試劑，根據試劑盒說明書，將miR-210 mimic和anti-miR-210抑制劑分別轉染至卵巢癌細胞株。轉染48 h后，提取總RNA，用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,采用Real-time PCR法檢測卵巢癌細胞株中miR-210的表達水平。實驗以GAPDH作為內部參照。結果計算采用比較閾值法，即目的基因的量=2-ΔΔCt，將Real-time PCR得到的Ct值轉化成miRNA的擴增倍數，ΔΔCt=(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)。

1.4MTT法檢測轉染后卵巢癌細胞的生長將處于對數生長期經轉染的卵巢癌細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度至5×104mL-1。于96孔細胞培養板中每孔加入100 μL細胞懸液，將細胞置于5% CO2、37℃培養箱中孵育。每48 h取3孔細胞，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g·L-1)，然后繼續培養4 h，之后取出細胞,每孔加入150 μL DMSO，將細胞培養板置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解,在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值，以A值代表卵巢癌細胞的增殖活性。

1.5MTT法檢測電離輻射條件下過表達miR-210卵巢癌細胞的生長細胞照射條件：美國Varian 23Ex醫用高能電子直線加速器，6 MV X射線照射，照射源到液面距離100 cm,劑量率300 cGy·min-1。將處于對數生長期的過表達miR-210的卵巢癌細胞接種于6孔細胞培養板中。采用不同劑量(30、50和100 Gy)的離子輻射作用于細胞，然后消化處理細胞轉種至96孔板,采用MTT法檢測經放射處理后的過表達miR-210卵巢癌細胞的增殖活性，操作步驟見1.4。

1.6Western blotting法檢測電離輻射條件下過表達miR-210卵巢癌細胞中相關凋亡蛋白表達收集經放射處理后的卵巢癌細胞，加入適量細胞裂解液于冰上靜置15 min后，低溫下離心，收取上清液，用BCA Protein Assay Kit測定細胞總蛋白濃度。將待電泳的蛋白樣品用SDS-PAGE蛋白電泳上樣緩沖液混和，于100℃加熱5 min。將蛋白樣品加樣于SDS-PAGE進行電泳分析，然后依次進行轉膜，于室溫下采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗于4℃孵育過夜。次日洗膜后加入二抗于室溫下孵育1 h。使用Super Singal West Dura發光試劑盒檢測目的蛋白的表達,以GAPDH作為內參蛋白,得到的條帶采用凝膠成像分析儀進行灰度分析。

2　結　果

2.1Real-time PCR法鑒定過表達和低表達miR-210卵巢癌細胞模型卵巢癌細胞株OVCAR3和SKOV3轉染miR-210 mimic及anti-miR-210抑制劑后，采用Real-time PCR法驗證miR-210在OVCAR3和SKOV3細胞中的表達量。結果顯示：轉染miR-210 mimic后，OVCAR3和SKOV3細胞中miR-210表達水平明顯升高，而anti-miR-210抑制劑則抑制了OVCAR3和SKOV3細胞中miR-210的表達(P<0.05)。見表1。

表1轉染后卵巢癌細胞中miR-210表達水平

MiRNAOVCAR3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorSKOV3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitormiR?210580±2023000±501?575±15200±10?400±2519000±300?410±35180±20?

*P<0.05 compared with control group.

2.2過表達和低表達miR-210卵巢癌細胞增殖活性細胞轉染后，MTT法檢測腫瘤細胞增殖活性結果顯示：增加miR-210表達水平，OVCAR3和SKOV3細胞增殖活性增加(P<0.05)；降低miR-210表達水平，OVCAR3和SKOV3細胞增殖活性降低(P<0.05)。見表2。

表2過表達和低表達miR-210卵巢癌細胞的增殖活性

TimeOVCAR3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorSKOV3ControlMiR?210mimicControlAnti?miR?210inhibitorDay10．25±0．090．26±0．08?0．41±0．110．40±0．11?0．30±0．090．31±0．08?0．30±0．100．29±0．10?Day30．57±0．110．66±0．11?0．81±0．090．71±0．09?0．87±0．100．96±0．11?0．52±0．090．48±0．09?Day50．90±0．131．75±0．13?1．52±0．101．21±0．10?1．26±0．121．65±0．11?1．20±0．110．91±0．10?Day71．67±0．142．77±0．13?2．21±0．101．73±0．11?1．97±0．112．77±0．11?1．91±0．111．33±0．11?

*P<0.05 compared with control group.

2.3電離輻射條件下過表達miR-210卵巢癌細胞的增殖活性MTT檢測結果顯示：電離輻射條件下miR-210過表達組卵巢癌細胞增殖活性明顯高于對照組(P<0.05)。見表3和4。

表3電離輻射照射后過表達miR-210 OVCAR3細胞增殖活性

TimeLowdoseofradiation(30Gy)ControlMiR?210mimicMiddledoseofradiation(50Gy)ControlMiR?210mimicHighdoseofradiation(100Gy)ControlMiR?210mimicDay12．52±0．102．49±0．092．56±0．102．50±0．062．58±0．072．53±0．06Day31．85±0．111．99±0．10?1．45±0．101．60±0．09?1．31±0．101．56±0．06?Day51．09±0．101．53±0．11?0．88±0．091．22±0．09?0．65±0．111．08±0．09?Day70．53±0．111．20±0．10?0．32±0．110．88±0．09?0．11±0．110．59±0．10?

*P<0.05 compared with control group.

表4電離輻射照射后過表達miR-210 SKOV3細胞增殖活性

TimeLowdoseofradiation(30Gy)ControlMiR?210mimicMiddledoseofradiation(50Gy)ControlMiR?210mimicHighdoseofradiation(100Gy)ControlMiR?210mimicDay13．01±0．102．99±0．093．11±0．093．08±0．093．10±0．103．11±0．10Day32．45±0．102．58±0．11?2．25±0．102．43±0．09?1．99±0．102．17±0．09?Day51．63±0．072．09±0．11?1．45±0．111．88±0．06?1．11±0．111．57±0．09?Day70．84±0．111．58±0．10?0．80±0．121．38±0．12?0．29±0．110．82±0．11?

*P<0.05 compared with control group.

2.4電離輻射條件下過表達miR-210卵巢癌細胞中凋亡相關蛋白表達與對照組比較，過表達miR-210的OVCAR3和SKOV3細胞給予50 Gy放射線照射后，2株細胞中BAX表達水平均明顯下降，而Bcl-2表達水平均明顯升高。見圖 1。

Lane 1: Control group; Lane 2: miR-210 group.

圖1電離輻射照射后過表達miR-210 OVCAR3(A)和SKOV3(B)細胞中凋亡相關蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in OVCAR3 and SKOV3 cells overexpressing miR-210 after radiation

3　討　論

腫瘤的發生與細胞異常增殖、分化及凋亡密切關聯。研究[11]顯示：一些miRNA與腫瘤的發生、腫瘤細胞的生長和凋亡均有著密切的聯系。深入探討miRNA在腫瘤發生過程中的調控作用及機制，對于人們不斷認識和戰勝腫瘤具有重要的意義。miRNA與卵巢癌關系的研究也早已展開。miR-141、miR-200a、miR-200b和miR-200c等在卵巢癌中呈高表達，而miR-125b-1﹑miR-140和miR-145等呈低表達。這些不同表達的miRNA提示其在卵巢癌中起著不同的調控作用,同時也具有潛在治療靶點的意義[12]。隨后的研究[13-16]顯示：在早期卵巢腫瘤患者和健康人的血液中可檢測到一些差異表達的miRNA，并且這些miRNA表達水平與腫瘤的進展呈一定的相關性。這些研究結果進一步提示可通過檢測患者血液中的miRNA進行卵巢癌的早期診斷，并可針對差異表達的miRNA制定相應的治療方案。

miR-210是目前公認的缺氧特異性miRNA，在缺氧環境的細胞中表達明顯升高。腫瘤生長的特點是在缺氧和氧化應激之間轉變。在乏氧持續刺激下miR-210的表達最突出。提示這可能是癌癥細胞在腫瘤發病中的一個原因。以往有研究[17]顯示：miR-210可以通過抑制靶基因的轉錄而調節乳腺腫瘤細胞的生長。最近的研究[18]顯示：在卵巢癌組織中miR-210表達水平明顯升高，提示miR-210可能與卵巢癌的發生發展有著密切的聯系。

近年來，研究[19]顯示：miR-210除了參與卵巢癌的發生發展外，還與卵巢癌的化療耐藥有關，miR-210可能通過HOXA9、FGFRL1、EFNA3、VEGF和E2F3等參與其耐藥的形成,但目前對于miR-210與卵巢癌放療相關性的研究相對較少。卵巢癌發病率較高，預后較差，死亡率高居婦科惡性腫瘤首位，其中最重要一個原因為卵巢癌患者在放療治療過程中產生抵抗[20]。因此闡明卵巢癌輻射抵抗的確切機制已成為當前醫學研究中極其緊迫而重要的研究課題。

基于上述理論和研究結果，本文作者應用細胞轉染法制備miR-210過表達及低表達模型，采用Real-time PCR法進行鑒定，通過MTT法檢測miR-210對卵巢癌生長的影響，結果顯示：miR-210過表達有明顯的促進卵巢癌生長作用。為了驗證其與放療的敏感性，本文作者設置低﹑中和高3個輻射劑量組，對過表達miR-210卵巢癌細胞進行照射，結果顯示：過表達miR-210細胞組細胞對輻射存在一定的抵抗，這種輻射抵抗也許與miR-210表達異常有關；為了明確其分子機制，本文作者對其凋亡相關蛋白進行了檢測，結果顯示：凋亡相關蛋白BAX表達下降，而Bcl-2表達升高，提示這種輻射抵抗是通過抑制凋亡實現的。

隨著對miR-210的進一步深入研究，本文作者發現miR-210在卵巢癌治療中確有潛在的作用，有可能成為新的基因治療途徑。但miR-210是否直接或間接參與卵巢癌侵襲、轉移和復發尚需進一步研究。

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