痛風寧膠囊對大鼠急性痛風性關節炎的抗炎作用及其機制

樊海瑞，趙　巖，傅警龍，張海波，王德超，郜玉鋼，張連學

(1.吉林農業大學中藥材學院人參工程技術研究中心，吉林 長春130118；2. 吉林省長春市長中風濕骨病醫院風濕科，吉林 長春130000)

痛風性關節炎(gouty arthritis,GA)是機體嘌呤代謝紊亂導致尿酸(uric acid，UA)增加或排泄減少使尿酸鹽結晶沉積于軟骨、滑膜和關節囊引發關節與周圍軟組織發生的病理變化與炎癥反應[1]，若不及時進行正確的治療會使關節嚴重受損甚至導致殘疾[2]。隨著國家經濟發展和人們飲食結構的變化,痛風的患病率呈逐年上升的趨勢[3]。目前用于治療痛風的藥物主要有秋水仙堿、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抑制劑、非甾體抗炎藥(NSAIDs)、促腎上腺皮質激素類(ACTH)和皮質類固醇類等。此類藥物雖作用迅速、效果明顯，但患者需長期使用且常伴有嚴重的不良反應[4-5]，如秋水仙堿具有惡心、腹瀉等不良反應；非甾體抗炎藥會導致腎損傷或胃腸道潰瘍、出血等，IL-1β抑制劑有加重痛風癥狀的危險[6-7]。由于以上不良反應，臨床遇到對各種藥物使用的限制問題。而傳統中醫藥在治療疾病方面具有不良反應小等優點，因此開發治療痛風中藥是目前亟待解決的問題。我國研究人員[8-13]在創建相關模型、藥物療效等領域做了大量研究，并且已證實中藥具有治療痛風及其并發癥的效果。

TFN組方為長春中醫藥大學風濕醫院臨床多年應用的經驗方，在臨床上使用十余年[14]。本研究探討不同劑量TFN對尿酸鈉誘導大鼠急性痛風性關節炎的治療作用與作用機制，為進一步開發和利用TFN提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SD雄性大鼠，體質量為(200±10) g，由吉林省長春市生物制品研究所有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK(吉)2011-0003。痛風寧膠囊(TFN)(組方由土茯苓、澤蘭、蠶砂、黃柏、大黃和金錢草等21味中藥組成；口服制劑，由吉林省長春市長中風濕骨病醫院提供，規格：0.5 g；批準文號：吉藥制字Z2007A050)。秋水仙堿(規格：0.5 mg，批準文號：國藥準字H20113208)，廣東彼迪藥業有限公司。尿酸鈉(U2875-5G，美國Sigma公司)。UA、一氧化氮(NO)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 等ELISA試劑盒(美國R&D公司)，其他試劑均為分析純。分析天平(ABS 320-4N型)(上海島韓實業有限公司),酶標儀K[SPECTRAMAX 190，美谷分子儀器(上海)有限公司],CT14D臺式高速離心機(天美科學儀器有限公司)。

1.2實驗動物模型制備[15-17]和分組取48只健康大鼠適應性飼養1周后隨機分為6組，即空白組，模型組，秋水仙堿陽性藥對照組，低、中和高劑量TFN組；每組8只。將大鼠仰臥固定于解剖板，右后肢小腿踝關節經醫用酒精消毒后，用6號注射針以踝關節外側為穿刺點，針口斜面朝上且與脛骨成45°刺入踝關節腔，有落空感。注入250 mg·mL-1尿酸鈉溶液0.2 mL，踝關節對側鼓起視為注射成功。除空白對照組注射等體積的無菌生理鹽水外，其他各組均注射0.2 mL上述尿酸鈉溶液。制作大鼠急性GA模型。

1.3給藥方式大鼠每天上午灌胃給藥，根據人與實驗動物給藥量的劑量換算[18]，低、中和高劑量TFN組給藥劑量分別為100、200和550 mg·kg-1。陽性對照組大鼠灌服秋水仙堿0.63 mg·kg-1。其他組灌胃蒸餾水。連續給藥9 d，第7天 給藥30 min后按上述1.2法造模。

1.4檢測方法和觀察指標[19-20]造模后2、4、6和8 h用寬度為1 cm紙條測量每組大鼠踝關節同一部位周長(單位mm，記號筆標記)，計算腫脹度。腫脹度=(造模后踝關節周長-造模前踝關節周長)/造模前踝關節周長。實驗第9天 給藥30 min后，將每組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于解剖板，取腹主靜脈血，一部分置于采血管檢測血液中白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞(1×10-9L-1)。另一部分置于離心管放置室溫下1 h后離心(3 500 r·min-1，12 min)取上清，在-70℃條件下凍存待測UA和NO水平。取血之后處死大鼠，置于冰凍干燥托盤內，快速分離踝關節周圍軟組織、關節液于勻漿管內離心取上清，放置在-20℃保存，待測IL-1β、TNF-α及NO水平。以上UA、NO、IL-1β和TNF-α等指標均按試劑盒說明書采用酶聯吸附實驗測定。

2　結　果

2.1各組大鼠關節腫脹度與空白對照組比較，模型組大鼠在0～8 h內踝關節腫脹度明顯升高(P<0.01)，表明大鼠急性痛風性關節炎造模成功。與模型組比較，陽性藥對照組和高劑量TFN給藥組大鼠在2～8 h踝關節腫脹度明顯降低(P<0.05或P<0.01)，在4 h時效果最為顯著(P<0.01)。低和中劑量TFN組大鼠踝關節腫脹度亦降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。TFN量效之間符合正態分布。

表1各組大鼠踝關節腫脹度

GroupDose(mg·kg-1)Degreeofjointswelling(t/h)　02468Blankcontrol00．19±0．030．21±0．040．22±0．050．23±0．060．21±0．05Model00．26±0．06?0．32±0．07?0．36±0．07?0．39±0．07?0．44±0．09?Positivedrugcontrol0．630．21±0．04△0．24±0．04△△0．29±0．05△0．33±0．06△0．34±0．06△△TFN　Lowdose1000．25±0．060．31±0．050．35±0．060．37±0．060．38±0．06　Middledose2000．24±0．050．28±0．060．34±0．050．36±0．060．37±0．05　Highdose5500．21±0．04△0．25±0．05△0．28±0．05△△0．34±0．04△0．35±0．06△△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.2各組大鼠全血中白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞水平與空白對照組比較，模型組大鼠白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞水平有明顯升高的趨勢；與模型組比較，陽性藥對照組和高劑量TFN組大鼠白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量明顯減少(P<0.05)；中劑量TFN組大鼠白細胞數量明顯減少(P<0.05)，但淋巴細胞與中性粒細胞數量無明顯變化(P>0.05)。見表2。TFN量效之間符合正態分布。

2.3各組大鼠血清UA和NO水平與空白對照組比較，模型組大鼠血清UA水平明顯升高(P<0.01)，NO水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥對照組和高劑量TFN組大鼠血清中UA水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，NO水平明顯升高(P<0.05)。低和中劑量TFN組較模型組雖有改善，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。TFN量效之間符合正態分布。

表2各組大鼠白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量

Tab.2Number of WBC， lymphocytes and neutrophils of rats in various groups

GroupDose(mg·kg-1)WBCLymphocyteNeutrophilBlankcontrol07．76±0．8161．45±8．2616．95±2．43Model015．91±3．83??75．86±8．95?21．23±4．37?Positivedrugcontrol0．6311．46±2．54△63．48±7．77△17．54±3．71△TFN　Lowdose10014．08±3．3772．53±8．9924．14±3．21　Middledose20012．05±3．16△71．26±9．0221．05±2．81　Highdose55011．70±3．09△64．40±7．05△17．33±3．82△

*P<0.05,**P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

表3各組大鼠血清中UA和NO水平

GroupDose(mg·kg-1)UA[ρB/(g·L-1)]NO[cB/(μmol·L-1)]Blankcontrol09．55±2．0036．85±5．26Model018．12±2．33?25．14±4．22?Positivedrugcon?trol0．6311．82±2．55△32．19±5．11△TFN　Lowdose10017．12±1．8427．75±3．13　Middledose20016．70±1．8427．24±5．78　Highdose55012．57±2．16△31．64±4．01△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.01vsmodel group.

2.4各組大鼠踝關節組織和關節液中炎癥因子及NO水平與空白對照組比較，模型組大鼠踝關節組織和關節液中NO、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥對照組和高劑量TFN組NO、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。低和中劑量TFN組較模型組NO、TNF-α和IL-1β水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。TFN量效之間符合正態分布。

表4各組大鼠踝關節組織和關節液中炎癥因子和NO水平

GroupDose(mg·kg-1)TNF?α[ρB/(ng·L-1)]IL?1β[cB/(μmol·L-1)]NO[cB/(μmol·L-1)]Blankcontrol0267．15±30．5821．34±4．3614．00±1．99Model0342．07±41．24?38．08±4．00?29．70±3．02?Positivedrugcontrol0．63286．47±38．00△△26．86±3．05△△19．68±2．01△△TFN　Lowdose100337．48±47．2536．40±5．5527．12±4．72　Middledose200327．42±44．3834．95±5．1125．30±3．99△　Highdose550289．60±37．91△△27．32±4．03△△20．86±4．21△△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

3　討　論

本實驗通過向大鼠關節腔注入尿酸鈉建立急性痛風性關節炎模型，此法由于效率高且其病理表現與臨床極為相似，已被作為經典的急性痛風性關節炎造模法。導致關節炎臨床特征的原因之一是由于尿酸鈉(monosodium urate,MSU)沉積產生了大量的NO。研究[3,21]顯示：TNF-α和IL-1β為前炎癥網鏈內一級細胞因子，其存在使炎癥惡化，釋放大量的炎癥物質導致軟骨基質和骨的破損。中醫藥在治療痛風性關節炎上具有標本兼治的特點，且中藥復方聯合用藥具有增效和減毒的優勢[22-24]。因此研究與開發具有痛風治療效果的中藥復方具有重要意義。

本研究結果顯示：TFN不僅可以降低UA水平，還能夠降低TNF-α和IL-1β水平，升高血清NO水平，降低組織中NO水平及血清UA水平，可以減小急性痛風性關節炎大鼠踝關節腫脹度，且與劑量呈正相關關系，高劑量組效果最顯著。

綜上所述，TFN治療急性痛風性關節炎的機制可能與抑制炎癥因子的釋放和降低血液中白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量有關聯。而且實驗動物在治療過程中無不良反應出現。TFN為長中風濕骨病醫院臨床多年應用的經驗方，在臨床上使用十余年，但是對于其藥理活性缺乏研究。組方中藥物含有豐富的生物堿及黃酮類等化合物，且生物堿、黃酮類化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素和桑色素等對痛風有重要作用[25]，因此本研究結果對于進一步探討TFN治療痛風性關節炎的療效具有重要意義。

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