水流動力學注射對小鼠肝損傷及肝臟的自然修復作用

李勝男，張海英，孫千惠，李艷茹，葛　鶴，杜　瑜，王　琳

(吉林大學基礎醫學院病理學系 病理生物學教育部重點實驗室， 吉林 長春 130021)

水流動力學注射(hydrodynamic injection)是將大體積(占小鼠體質量的8%～10%)質粒DNA溶液經小鼠尾靜脈在5～8 s內快速注射入小鼠體內，進而獲得轉基因表達的方法，通常轉基因在肝臟表達最多[1]。除DNA外，已成功應用此方法將RNA、蛋白甚至病毒等轉移到動物體內，廣泛應用于基因功能測試、基因治療等研究以及病毒性肝炎模型的制備等[2-3]。由于靜脈注射的大體積質粒DNA溶液迅速進入體循環，使心臟負荷過重，導致大量的液體淤積在肝臟，肝內壓力升高，迫使肝竇內皮細胞窗增大，肝細胞膜出現暫時性小孔，質粒DNA進入肝細胞，進而表達目的基因[4]。此方法產生的壓力將基因送入肝細胞的同時，也可能引起肝竇內皮細胞和肝細胞損傷。但是關于肝臟的形態學改變的研究[5]極少，其修復過程尚不清楚。本研究通過水流動力學注射法制備小鼠肝損傷模型，觀察肝臟在損傷及修復過程中的形態學變化，檢測與修復有關的因子，為更好地利用此方法進行科學研究提供依據，為進一步探討水流動力學注射性肝損傷的修復機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物和肝損傷模型制備31只雌性Balb/c小鼠，體質量為18～20 g，購自吉林大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(吉)-2003-0001。用26 G針頭將小鼠體質量10%的生理鹽水(1.8～2.0 mL)在3 s內經尾靜注射入小鼠體內。按照注射后時間點將小鼠分為5組：30 min組、8 h組、1 d組、3 d組和7 d組，每組5只。以6只未注射小鼠為對照組，記為0 min組。

1.2各組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)測定注射生理鹽水后，于不同時間點經內眥靜脈取血，按照ALT試劑盒(上海科華-東菱診斷用品公司)說明檢測血清ALT水平。

1.3肝臟形態學觀察分別于注射后不同時間點處死小鼠并稱體質量。取肝臟觀察大體改變，制備石蠟切片，經蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察病理學改變。為了確定肝臟病理學改變的區域，根據參考文獻[5]將圍繞門靜脈周圍的肝細胞區域定為門靜脈區，即1區；圍繞在中央靜脈周圍的肝細胞區域定為中央靜脈區，即3區；介于二者之間的肝細胞區域為2區。每只小鼠分別選取10個有代表性的區域，統計每高倍視野下的肝細胞數及雙核細胞數。

1.4免疫組織化學染色上述制備的石蠟切片，利用免疫組織化學染色(SP法)觀察增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達情況。一抗為鼠抗人PCNA單克隆抗體(福州邁新，1∶300)，二抗為羊抗鼠/兔IgG(福州邁新)，DAB溶液顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗作為陰性對照。PCNA陽性表現為細胞核呈棕黃色。每只小鼠肝組織切片內分別選取10個視野，計算肝細胞及膽管細胞PCNA陽性細胞百分數，將其作為PCNA指數。

1.5Real-time PCR法檢測基因表達水平按照RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)說明書提取肝組織總RNA；根據Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(日本TaKaRa公司)說明書進行逆轉錄反應(RT)，按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (瑞士Roche公司)說明書進行Real-time PCR法檢測，利用ABI 7300實時熒光定量PCR儀(美國 ABI公司)檢測各組小鼠肝組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、轉化生長因子α(transforming growth factor-α，TGF-α)、Cyclin D1、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Bax和Bcl-2 mRNA表達水平，基因相對表達水平以2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內參基因) -(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)。以m-Arbp和β-actin為內參，引物設計見表1。

表1　引物序列

2　結　果

2.1各組小鼠肝臟大體改變和血清ALT水平水流動力學注射后，小鼠抽搐、呼吸急促，數秒鐘后恢復正常；體質量增加約10%，8 h后體質量恢復。與對照組(0 min組)比較，30 min組小鼠肝質量/初始體質量比無明顯變化，8 h組明顯下降(P<0.05)，1 d 組和7 d組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。對照組小鼠肝臟呈灰白色，表面無出血點；30 min組小鼠肝臟呈灰紅色；8 h組小鼠肝臟表面出現黑紅色片狀出血區；1 d組小鼠肝臟表面仍可見片狀出血區；3 d組小鼠出血區面積減小；7 d組小鼠肝臟呈灰白色，與對照組相似。見圖1(插頁四)。30 min組和8 h組小鼠血清ALT水平明顯低于對照組(P<0.01)，1 d組明顯高于對照組(P<0.01)，7 d組差異無統計學意義(P>0.05)。

表2各組小鼠肝質量/初始體質量比值和血清ALT水平

GroupRatioofliverweight/originalbodyweightALT[λB/(U·L-1)]Control　(0min)0．064±0．01027．00±2．9630min0．065±0．0063．40±1．82??8h0．049±0．005?3．00±1．58??1d0．064±0．005250．50±62．69??3d0．063±0．00347．80±7．397d0．077±0．00529．20±5．26

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

2.2肝組織形態學表現對照組(0 min組)小鼠肝小葉結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心，沿肝細胞索呈放射狀排列，肝竇清晰。30 min組小鼠出現大量腫脹的肝細胞，胞質淡染，成群分布，主要位于1區和2、3區之間；此外，腫脹區域內可見小面積出血，肝細胞索被破壞；每高倍視野下肝細胞數明顯少于對照組(q=4.760，P<0.05)。見圖2(插頁五)和表3。8 h組小鼠腫脹細胞數量較30 min組明顯減少，而出血更加明顯，肝細胞、肝竇內皮細胞被破壞，可見紅細胞進入腫脹的肝細胞內，在出血壞死灶周圍未受損區域內可見雙核肝細胞及核分裂象(圖2，見插頁五)；與30 min組比較，肝細胞數明顯增多(q=7.310，P<0.01)，雙核細胞數也明顯增多(q=7.200，P<0.01)。1 d組出血壞死灶面積減小(圖2，見插頁一)，肝細胞數明顯少于8 h組(q=4.966，P<0.05)，雙核細胞數也明顯少于8 h組(q=6.596，P<0.01)，但是二者與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。3 d組除靠近肝臟表面處有個別出血灶外，肝實質內出血壞死灶基本消失，肝細胞數及雙核細胞數與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。7 d組肝組織結構與對照組相似，肝細胞、雙核細胞數量與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有時間點均未見膽管上皮細胞的破壞。

表3每高倍視野下各組小鼠肝組織內細胞數量

GroupNo．ofhepatocytesNo．ofbinuclearhepatocytesControl(0min)78．5±7．69．4±3．230min65．4±10．0?7．6±2．68h88．0±9．7△15．2±3．3△1d71．4±2．0#7．8±0．9##3d78．0±3．76．7±0．67d77．4±3．37．6±0．7

*P<0.05vscontrol group;△P<0.01vs30 min group;#P<0.05,##P<0.01vs8 h group.

2.3各組小鼠肝組織PCNA表達免疫組織化學染色結果顯示：PCNA陽性肝細胞主要位于2、3區受損區域周圍。8 h組PCNA指數較對照組升高(t=4.458,P<0.01)，1 d組最高，且明顯高于對照組(t=15.557,P<0.01)，7 d組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。30 min組匯管區膽管細胞PCNA指數明顯高于對照組(t=3.985,P<0.01)，隨后降低，7 d組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4各組小鼠肝組織中多種因子的表達30 min組小鼠肝組織中TNF-α mRNA水平明顯高于8 h組(q=4.952，P<0.05)；8 h組仍高于7 d組(q=8.461，P<0.01)。30 min組小鼠肝組織中IL-6 mRNA水平明顯高于8 h組(q=14.750，P<0.01)，8 h組明顯高于7 d組(q=6.923，P<0.01)。30 min組各組小鼠肝組織中EGF mRNA 水平明顯高于8 h組(q=14.750，P<0.01)。3 d組各組小鼠肝組織中HGF mRNA 水平明顯高于30 min 組和8 h組(q=5.031，P<0.05；q=4.631，P<0.05)。8 h組和3 d組TGF-α mRNA水平均明顯高于30 min 組(q=4.592，P<0.05；q=8.137，P<0.01)。8 h和1 d組Cyclin D1 mRNA水平均明顯高于7 d組(q=4.736，P<0.05；q=5.213，P<0.05)。30 min組各組小鼠肝組織中VEGF mRNA水平明顯高于8 h組(q=13.551，P<0.01)。1 d組Bax/Bcl-2 mRNA 比值明顯高于30 min組(q=5.731，P<0.01)。見表4。

3　討　論

肝再生主要是由殘存的健康成熟肝細胞通過增殖完成[6]，除肝細胞外，膽管細胞能夠通過TNF-α、IL-6和VEGF等因子的釋放對組織損傷做出反應，并在上述因子的調節下，進行與膽管修復有關的增殖、凋亡以及血管生成[7]。另外，Kupffer細胞、肝星形細胞和肝竇內皮細胞可通過分泌多種細胞因子而參與肝再生，如TNF-α、IL-6以及VEGF等[8]。本實驗中，注射后30 min，肝細胞數明顯少于對照組，這是由于此時肝細胞腫脹、體積增大，導致單位面積內細胞數減少所致[5]；注射后8 h肝細胞數以及雙核細胞數明顯多于30 min，肝細胞PCNA指數也明顯高于30 min，這些增多的肝細胞可能是為了維持肝臟功能而產生。注射后8 h，出現彌漫的片狀出血壞死灶，說明此時肝竇內皮細胞受到破壞，但是在注射后7 d，出血壞死消失，肝組織結構恢復正常。膽管細胞PCNA指數在注射后30 min高于其他時間點。以上結果說明：在水流動力學注射引起的肝損傷中，肝細胞、膽管細胞和肝竇內皮細胞均參與了肝組織修復。

圖3　各組小鼠肝組織PCNA指數

Fig.3PCNA indexes in liver tissue of mice in various groups

表4各組小鼠肝組織中肝再生相關因子的mRNA相對表達水平

GroupTNF?αIL?6EGFHGFTGF?αCyclinD1VEGFBax/Bcl?230min3．43±1．1813．45±3．091．81±0．470．39±0．080．42±0．121．28±0．252．05±0．110．50±0．178h1．48±0．40?1．36±0．32??0．93±0．28??0．42±0．240．88±0．27?1．82±0．650．69±0．28??0．94±0．421d0．68±0．140．95±0．411．00±0．080．48±0．180．82±0．282．02±0．851．00±0．231．36±0．38??3d0．60±0．170．57±0．230．97±0．260．84±0．31?△1．52±0．75??1．29±0．72#1．37±0．190．80±0．287d0．40±0．15△△0．46±0．07△△0．88±0．440．74±0．100．79±0．170．77±0．37△#1．17±0．140．68±0．32

*P<0.05,**P<0.01vs30 min group;△P<0.05,△△P<0.01vs8 h group;#P<0.01vs1 d group.

本實驗中，小鼠在水流動力學注射后30 min及8 h肝組織出現肝細胞腫脹、肝細胞壞死及出血，因肝細胞壞死導致8 h 時肝質量/初始體質量比下降，ALT釋放入血，但是因為體內注射了大量的液體，導致ALT濃度被稀釋，使測得的30 min及8 h組血清ALT值明顯低于對照組。注射后8 h，肝組織壞死的同時，肝細胞開始大量增殖，表現為肝細胞(含雙核肝細胞)數量增加。1 d時，注射的液體已經被機體排出，1 d組小鼠血清ALT達到峰值，此時肝組織內出血、壞死灶明顯減少，肝質量/初始體質量比也恢復到對照組水平，肝細胞數也與對照組相似。到注射后3 d，ALT水平、肝細胞數、PCNA指數均與對照組無差別，肝臟組織結構基本恢復正常。這與Budker等[5]的研究結果基本一致，即損傷快速出現、快速消退。

目前研究[9]認為：急性肝損傷時肝臟的再生是一個快速發生的過程，主要包括啟動期、增殖期和終止期。在啟動階段，有多種細胞因子和生長因子參與調控，其中TNF-α和IL-6使肝細胞由G0期進入G1期。在四氯化碳(CCl4)誘導的肝損傷模型中，TNF-α和IL-6 mRNA表達水平在CCl4處理后1 d最高；使用TNF-α抗體或者敲除TNF-α受體(TNFR1)導致TNF-α耗盡或缺失均會引起肝再生障礙，并且這與NF-κB和STAT3活化受阻從而不能誘導IL-6的表達有關[8]。肝切除后，TNF-α與非實質細胞，尤其是Kupffer細胞的受體結合，激活NF-κB信號通路產生IL-6，IL-6與肝細胞上的IL-6受體結合，激活肝細胞內STAT3以及ERK1/2信號通路，隨后進行DNA復制，完成肝再生[10]。TNF-α和EGF聯合可促進肝再生過程中的DNA復制。在增殖階段，HGF、TGF-α和EGF等促有絲分裂原可通過 Ras-MAPK 和PI3K/AKT信號通路促進肝細胞DNA合成和細胞增殖[8]。EGF與EGFR結合后，通過促進Cyclin D1表達調節肝細胞增殖[11]。VEGF能夠促進血管生成。在肝切除模型中，VEGF可以通過肝竇內皮細胞增殖，重建肝竇，促進肝細胞增殖。Bockhorn等[12]研究發現：肝切除后24 h，VEGF處理組肝細胞增殖極高，而VEGF抗體處理組肝細胞增殖幾乎被完全抑制；VEGF通過與VEGFR結合刺激肝竇內皮細胞增殖，并釋放IL-6和HGF，從而參與肝臟的修復。凋亡在肝臟的再生和終止階段發揮作用[13-15]。

本實驗中，注射后30 min時TNF-α、IL-6、EGF和VEGF mRNA表達水平明顯升高，而Bax/Bcl-2比值較低。8 h時TNF-α和IL-6仍很高，此時Cyclin D1 也升高。1 d時Cyclin D1和Bax/Bcl-2比值較高，3 d時HGF和TGF-α水平較高。本文作者推測：在水流動力學注射造成肝損傷后，快速升高的TNF-α和IL-6啟動了修復的過程，使肝細胞從G0期進入G1期；EGF通過Cyclin D1使肝細胞進入增殖階段，VEGF促進肝竇內皮細胞增殖和肝竇的修復；而后期的修復停止，可能是由促凋亡的Bax基因以及HGF和TGF-α共同發揮作用完成的。

綜上所述，水流動力學注射可引起急性肝損傷，主要表現為肝細胞腫脹并形成出血、壞死灶，肝損傷后可迅速啟動修復過程，損傷可在1周左右通過細胞增殖自然修復；與肝再生有關的多種細胞因子和生長因子參與修復過程，但是具體機制仍有待于進一步研究。

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