五味子脂A聯(lián)合卡鉑對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其機(jī)制

上官夢(mèng)原，趙　菁，楊艷榮，張佳悅，陳俊宇，趙淑華

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041； 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 延吉 133000；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是患者治療失敗的主要原因，有效控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療的關(guān)鍵。鉑類(lèi)是治療卵巢癌的主要化療藥物，但具有選擇性差、不良反應(yīng)強(qiáng)和易產(chǎn)生耐藥等缺點(diǎn)。近年來(lái)，從中藥材中篩選有效成分逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性成為研究熱點(diǎn)。研究[1-3]發(fā)現(xiàn)：五味子有效成分可發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究選取五味子化學(xué)成分五味子脂A(gomisin A,GA)作為研究對(duì)象，觀察其與卡鉑(carboplatin,CBP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為更加合理、有效的臨床化療聯(lián)合用藥方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌Skov3細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺疾病防治中心保存。GA(純度98%)購(gòu)于上海源葉生物制品有限公司，注射用卡鉑注射液為齊魯制藥有限公司生

產(chǎn)，IMDM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連寶信生物工程有限公司，Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組人卵巢癌Skov3細(xì)胞株用含10% FBS 的IMDM培養(yǎng)液，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d傳代1次，傳代比率 1∶3，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究分2步：首先選擇不同濃度GA和CBP(GA濃度分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1，CBP濃度分別為0、4、8、16、32和64 mg·L-1)單獨(dú)應(yīng)用和分別組合后觀察其對(duì)Skov3細(xì)胞增殖能力的影響，然后根據(jù)其結(jié)果選擇聯(lián)合用藥的合適濃度，分為對(duì)照組、GA(0.04 μmol·L-1)組、CBP(16 mg·L-1)組、GA(0.04 μmol· L-1)聯(lián)合CBP(16 mg·L-1)組(GA+CBP組)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化細(xì)胞后制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3 000個(gè)/孔，接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。分為對(duì)照組、GA組、CBP組和GA+CBP組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥后5%CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育。細(xì)胞給藥48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1) 10 μL，37℃孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液150 μL。振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1/實(shí)驗(yàn)組A值-1/對(duì)照組A值)×100%。

1.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞形成克隆能力將Skov3細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞密度為500個(gè)/孔，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、GA組、CBP組和GA+CBP組，48 h后吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，結(jié)晶紫染色。觀察各組集落形成情況，在顯微鏡(低倍鏡)下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。按公式計(jì)算克隆形成率，并拍照記錄。克隆形成率=(細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將Skov3細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合，用200 μL移液槍頭沿?zé)o菌格尺在每孔中央部縱向劃痕，除去培養(yǎng)液，加入2 mL PBS仔細(xì)洗滌3次，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h后給藥。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、GA組、CBP組和GA+CBP組，給藥后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)遷移情況，并拍照記錄。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12～18 h后，消化細(xì)胞并用無(wú)血清IMDM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL-1。Transwell試劑盒室溫放置30 min預(yù)溫，將小室置于24孔板中，加入300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基至上室內(nèi)部，室溫下水化細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)30 min后，吸棄250 μL培養(yǎng)基。向每個(gè)上室加入無(wú)血清細(xì)胞懸液250 μL，向下室加入含10%胎牛血清的IMDM 500 μL。上室、下室分別加藥至同等濃度，繼續(xù)孵育30 h。取出小室移除殘留培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，瑞氏-姬姆薩染色后，倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.7Real-time PCR檢測(cè)Skov3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平將Skov3細(xì)胞接種于6孔板，給藥孵育48 h后，使用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物序列：MMP-2上游引物5′-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3′，下游引物5′-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3′；MMP-9上游引物5′- CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3′，下游引物5′-CCACCCGAGTGTAACCATAGC-3′；GAPDH 上游引物5′-GGAAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGAAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件：94℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃、5 min。以GAPDH為內(nèi)參照，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算各基因的mRNA表達(dá)水平。

1.8Western blotting法檢測(cè)Skov3細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、AKT1和pAKT1蛋白表達(dá)水平在100 mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，給藥后繼續(xù)孵育48 h。離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，離心收集上清，采用BCA 法測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣本中不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，孵育一抗，抗體稀釋比例分別為MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)、AKT1(1∶1 000)、pAKT1(1∶1 000)和β-actin(1∶500)，4℃過(guò)夜。TBST洗3次后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，TBST洗3次。DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組灰度值之比表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率隨著濃度的增加，GA和CBP對(duì)Skov3細(xì)胞增殖抑制率明顯升高。單獨(dú)應(yīng)用GA(0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1)干預(yù)后，Skov3細(xì)胞增殖抑制率為9.4%～21.3%；單獨(dú)應(yīng)用CBP(4、8、16、32和64 mg·L-1)干預(yù)后，Skov3細(xì)胞增殖抑制率為14.6%～27.2%，而聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖抑制率最高為52.1%，高于同濃度GA組和CBP組(P<0.01)，且GA和CBP濃度分別為0.04 μmol·L-1和16 mg·L-1時(shí)量效比最佳。見(jiàn)圖1。

n=6,*P<0.01 compared with GA group;△P<0.01 compared with CBP group.

圖1不同濃度GA和CBP組Skov3細(xì)胞增殖抑制率

Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of Skov3 cells in GA and CBP groups with different concentrations

2.2各組細(xì)胞克隆形成率對(duì)照組、GA組、CBP組和GA+CBP組克隆形成率分別為60%、42%、31%和19%。與對(duì)照組比較，GA組Skov3細(xì)胞克隆形成率有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CBP組和GA+CBP組克隆形成率明顯降低 (P<0.05或P<0.01)。與GA組和CBP組比較，GA+CBP組細(xì)胞克隆形成率明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與對(duì)照組比較，GA和CBP組Skov3細(xì)胞轉(zhuǎn)移的數(shù)量均減少，劃痕的愈合面積減少；GA+CBP組Skov3細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯低于GA和CBP組，且細(xì)胞呈現(xiàn)明顯受抑制狀態(tài)。見(jiàn)圖3。

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

2.4各組細(xì)胞的侵襲能力與對(duì)照組比較，GA和CBP組Skov3細(xì)胞穿過(guò)ECM的能力降低，穿過(guò)并黏附于QCM TM膜的細(xì)胞減少；GA+CBP組Skov3細(xì)胞穿過(guò)ECM的能力進(jìn)一步降低，穿過(guò)并黏附于QCM TM膜的Skov3細(xì)胞進(jìn)一步減少。見(jiàn)圖4(插頁(yè)五)。

2.5各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，GA和CBP組MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與GA組和CBP組比較，GA+CBP組MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1各組Skov3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平

GroupMMP?2MMP?9Control0．99±0．210．98±0．22GA0．95±0．23?0．90±0．22?CBP0．78±0．20?0．77±0．20?GA+CBP0．55±0．10△#0．30±0．10△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

2.6各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，GA和CBP組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)；與GA組和CBP組比較，GA+CBP組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖5和表2。

Lane 1：Control group;Lane 2：GA group;Lane 3：CBP group;Lane 4：GA+CBP group.

圖5Western blotting法檢測(cè)各組Skov3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins in Skov3 cells in various groups

表2各組Skov3細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

GroupMMP?2MMP?9Control0．40±0．031．09±0．06GA0．33±0．04?0．68±0．03??CBP0．22±0．03??0．42±0．04??GA+CBP0．13±0．06△#0．50±0．04△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

2.7各組細(xì)胞中AKT1和pAKT1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，GA和CBP組細(xì)胞中AKT1和pAKT1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與GA和CBP組比較，GA+CBP組細(xì)胞中AKT1和pAKT1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖6和表3。

Lane 1：Control group;Lane 2：GA group;Lane 3：CBP group;Lane 4：GA+CBP group.

圖6各組Skov3細(xì)胞中AKT1和pAKT1蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.6Electrophoregram of expressions of AKT1 and pAKT1 proteins in Skov3 cells in various groups

表3各組Skov3細(xì)胞中AKT1和pAKT蛋白表達(dá)水平

GroupAKT1pAKT1Control0．69±0．030．44±0．05GA0．60±0．03?0．54±0．02?CBP0．30±0．02?0．27±0．02?GA+CBP0．23±0．01△#0．14±0．02△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

3　討　論

化療是卵巢癌輔助治療的重要手段，雖然術(shù)后輔助化療藥物不斷創(chuàng)新，但是對(duì)卵巢癌的治療效果并不理想。CBP是目前廣泛應(yīng)用的化療藥物之一 ，但存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)并易產(chǎn)生耐藥，因此急需開(kāi)發(fā)毒性小、治療效果好的新型抗腫瘤藥物，以降低腫瘤患者死亡率。近年來(lái)，天然、高效、低毒和來(lái)源廣泛的中草藥受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞。五味子具有廣泛的藥理成分，其抗腫瘤活性已被許多研究[4-6]所證實(shí)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的增殖能力有關(guān)。Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)：五味子脂可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK2、CDK4的表達(dá)。有研究[8]顯示：隨著五味子多糖濃度升高可明顯抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[9]顯示：?jiǎn)为?dú)使用GA和CBP均可抑制人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖，二者聯(lián)合應(yīng)用后抑制作用更為明顯，進(jìn)一步證實(shí)GA可增強(qiáng)CBP對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖的抑制作用,即以低濃度CBP與微量GA聯(lián)合用藥可達(dá)到高濃度CBP所產(chǎn)生的抑瘤效果，從而降低CBP的用量、減少其不良反應(yīng)。克隆形成率可反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力2個(gè)重要性狀，多被用于抗癌藥物的敏感性試驗(yàn)[10]。本研究通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：GA+CBP組Skov3細(xì)胞增殖能力被明顯抑制。PI3K-AKT信號(hào)通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)激活多個(gè)下游效應(yīng)分子，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究[11]顯示：與正常肝組織比較，肝癌細(xì)胞中AKT和pAKT的表達(dá)水平明顯升高，且隨腫瘤組織的臨床病理分期、分化程度不同而變化。在卵巢癌中，AKT過(guò)表達(dá)增加細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12]；目前研究[13-15]表明：PI3K-AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制可能是某些因素導(dǎo)致了蛋白激酶B(AKT)的過(guò)度活化。通過(guò)應(yīng)用PI3K-AKT抑制劑阻斷PI3K-AKT途徑，可提高卵巢癌細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性[16]。本研究采用Western blotting法檢測(cè)藥物處理后Skov3細(xì)胞中AKT1和p-AKT1蛋白水平，結(jié)果顯示：GA+CBP組細(xì)胞中AKT1和p-AKT1蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示GA可增強(qiáng)CBP對(duì)PI3K-AKT途徑的抑制作用，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

腫瘤細(xì)胞的遷移是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散的一種方式，黏附和侵襲過(guò)程增加了惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移需穿過(guò)ECM，繼而向組織浸潤(rùn)，因此ECM和基底膜的降解是腫瘤侵襲、發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過(guò)程的重要組成部分[17]。 本研究通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合用藥后細(xì)胞遷移能力明顯減弱，提示聯(lián)合用藥后抑制細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞降解ECM主要依賴(lài)蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可降解胞外基質(zhì)和基底膜，誘導(dǎo)腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,其中最具代表性的是MMP-2和MMP-9。研究[18]發(fā)現(xiàn)：當(dāng)MMP-2和MMP-9的表達(dá)或活性降低時(shí)，高轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞侵襲能力會(huì)明顯減弱。已有研究[19-21]表明：在卵巢惡性腫瘤中，MMP-2和MMP-9的過(guò)表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：GA+CBP組細(xì)胞內(nèi)MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低更加明顯，支持聯(lián)合用藥增強(qiáng)細(xì)胞的抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移能力的結(jié)論。

綜上所述，GA可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等多個(gè)環(huán)節(jié)從而增強(qiáng)CBP的抑瘤作用，其機(jī)制可能為抑制MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)，但其調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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