胸腺肽α1誘導MUC1特異性Th2型免疫應答

孫敏英，周紅月，接　晶，謝　飛，翟瑞萍，陳潭秀，袁紅艷，臺桂香

(1.吉林大學基礎醫學院醫學生物學實驗中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學基礎醫學院免疫學教研室，吉林 長春 130021)

胸腺肽α1(thmosin α1，Tα1)由28個氨基酸多肽組成，具有高度保守酸多肽結構。Tα1主要分布于胸腺組織，也存在于淋巴組織(如脾、淋巴結)和非淋巴組織(如肺、腎和腦)[1]，其分泌和釋放并不受其他激素或者釋放因子所調節[2]。盡管Tα1確切的免疫機制還不清楚，但是實驗[3]證實：Tα1具有強大的免疫調節作用，是一種細胞免疫增強劑和生物反應調節因子，在機體免疫應答過程中十分重要。大量的實驗數據[4-7]證實：Tα1不僅自身具有延緩腫瘤復發、改善免疫功能的作用，在與其他抗腫瘤藥物聯合使用時還可提高癌癥治療效果。MUC1是Mucins 黏蛋白家族成員，存在于正常腺管上皮細胞及其來源的腫瘤細胞表面,由多肽核芯(核芯肽)和側枝糖鏈構成，其核芯肽胞外段為20個氨基酸(SAPD TRPAP GSTAPPA HGVT) 的串聯重復序列(variable numbers tandem repeats,VNTRs)。正常組織的 MUC1 與腫瘤組織不同，前者分布于腺管上皮細胞分泌極，與免疫細胞相對隔離，糖基化豐富；而后者廣泛分布并異常豐富地表達于癌細胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細胞攻擊的靶點[8-9]，是制備腫瘤疫苗的理想分子。目前研制的以MUC1為靶點的疫苗包括糖疫苗、蛋白或多肽疫苗和DNA疫苗[10-12],其中蛋白疫苗具有一定的臨床應用前景。本課題組前期研究[13-14]以MUC1為靶點，研制黏蛋白與麥芽糖結合蛋白融合蛋白(mucin1-maltose binding protein fusion protein,MUC1-MBP)的抗腫瘤疫苗，表明MUC1-MBP聯合卡介苗(bacillus calmette-guérin,BCG)佐劑在小鼠體內可以誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL) 細胞毒的殺傷活性和Th1反應，可以抑制肺癌轉移及實體瘤的生長，具有明顯的腫瘤治療作用[13-16]。但由于BCG是減毒活疫苗，而且其活菌數較難控制，導致疫苗穩定性差，且高劑量BCG的不良反應較大，因此探索良好的腫瘤疫苗佐劑一直是本課題組的重要研究課題。由于Tα1具有免疫調節作用，本研究探討Tα1是否能作為MUC1-MBP的佐劑用于抗腫瘤治療，旨在為開發新的佐劑提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器67只雌性C57BL/6小鼠，體質量為18～20 g，6～8周齡，動物合格證號：SCXK(京)2014-0004，購自北京阜康生物科技股份有限公司。小鼠黑色素瘤細胞B16-MUC1由本室建立并保存，重組MUC1-MBP和MUC1-GST融合蛋白由本室重組構建及純化[6]。BCG購自石家莊開創生化公司，Tα1購自成都地奧九泓制藥廠，伊思柯夫改良培養液(Iscove’s modified Dubecco’s medium,IMDM)和 G418 購自美國 Gibco公司，FBS和小鼠淋巴細胞分層液購自天津市灝洋生物制品有限公司，ConA購自美國Sigma公司，小鼠抗人 MUC1購自美國Abcam公司，FITC-山羊抗小鼠 IgG和山羊抗鼠 IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠抗MBP 多克隆抗體購自基因公司，大鼠抗鼠 IgG1-HRP 和山羊抗鼠 IgG2a-HRP購自美國Southern Biotech公司，小鼠細胞因子干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)和白細胞介素10(IL-10) ELISA 檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。低溫冰箱和CO2孵箱購自日本SANYO公司，酶標儀購自美國BIOTEK公司，紫外分光光度計購自日本島津公司。

1.2小鼠分組與免疫方案①T細胞免疫活性檢測組。將21只C57BL/6小鼠隨機分成3組，每組7只，分別為生理鹽水組(注射生理鹽水)、MUC1-MBP+ BCG組(注射MUC1-MBP+BCG)和MUC1-MBP+ Tα1組(注射MUC1-MBP+Tα1)，其中MUC1-MBP+ BCG組為陽性對照組。 免疫方案：小鼠頸背部皮下多點注射，MUC1-MBP 50 μg/只，BCG 作為佐劑1 mg/只,Tα1為30 μg/只，隔周1 次，共注射3次。②MUC1特異性抗體檢測組：將25只C57BL/6小鼠隨機分成5組，每組5只，分別為生理鹽水組(注射生理鹽水)、MUC1-MBP 50 μg組、MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 15 μg組、MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 30 μg 組和MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 60 μg組，各組分別用生理鹽水調至400 μL。免疫方案：小鼠頸背部皮下多點注射及兩側腹股溝皮下注射，第1次免疫后2周，同等劑量加強免疫2次。③腫瘤模型組。將21只C57BL/6小鼠隨機分成3組，每組7只，分別為生理鹽水組(注射生理鹽水)、MUC1-MBP+BCG組(注射MUC1-MBP+BCG)和MUC1-MBP+ Tα1組(注射MUC1-MBP+Tα1)，其中MUC1-MBP+BCG組為陽性對照組。免疫方案：小鼠頸背部皮下多點注射，MUC1-MBP 50 μg/只，BCG作為佐劑1 mg/只, Tα1為30 μg/只，隔周1次，共注射3次。

1.3脾指數測定第3次免疫后第4～7天，先稱每只小鼠體質量，殺鼠，無菌取脾臟，稱脾臟質量，計算脾指數。脾指數 = 小鼠脾質量/體質量。

1.4 檢測各組小鼠的刺激指數(stimulus index，SI)和特異性SI在第3 次免疫后第4～7 天殺鼠，無菌取脾臟、研磨、細胞計數,制備脾細胞懸液，采用小鼠淋巴細胞分層液分離小鼠脾臟單個核細胞，采用IMDM調整細胞濃度至1×107mL-1每孔100 μL加入96孔板中。非特異性淋巴細胞增殖反應：實驗分為陰性對照組和ConA刺激組(終濃度5 mg·L-1)，每組設3復孔，37℃的 CO2培養箱中培養48 h后，加入WST-1檢測試劑每孔10 μL，繼續反應1 h，通過酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。MUC1特異淋巴細胞增殖反應：實驗分為陰性對照組、IL-2單獨刺激組(終濃度100 U·mL-1)和MUC1多肽刺激組(MUC1多肽20 mg·L-1+IL-2 100 U·mL-1)。37℃ 、CO2培養箱3 d，半量換液，繼續培養5 d后，吸取每孔細胞培養上清100 μL用于細胞因子的檢測，加入WST-1檢測試劑每孔10 μL，繼續反應1 h，通過酶標儀檢測450 nm波長處測量吸光度(A)值，計算SI。SI= 實驗孔A值/對照孔A值。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠脾細胞培養上清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平收集ConA刺激2 d和MUC1刺激5 d的淋巴細胞培養上清，按照IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10試劑盒說明書進行操作。包被抗體(抗IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的抗體)包被96孔酶標板，每個樣本設雙復孔，4℃過夜。采用PBS-0.05%Tween-20洗板5次，加入封閉液封閉1 h后，洗滌2次，加入標準品(IFN-γ：2 000.000、1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、32.500和15.625 ng·L-1；IL-2標準品配制：1 200、600、300、150和75 ng·L-1；IL-4 標準品配制：500.0、250.0、125.0、62.5、32.5、15.6、7.8和3.9 ng·L-1；IL-10標準品配制：200.0、100.0、50.0、 25.0和12.5 ng·L-1)和樣品，每孔100 μL，4℃過夜。洗滌5次，加入檢測抗體室溫孵育1 h，洗滌5次，加入酶標抗體Avindin-HRP,室溫孵育30 min。洗7次，加入TMB，室溫15 min。加入硫酸終止后，采用酶標儀于450 nm波長測定A值。計算IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。

1.6ELISA法檢測MUC1總抗體效價及亞類第3次免疫后第4 天，眶上靜脈采血，分離血清，通過間接ELISA試劑盒檢測MUC1特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a。首先將包被抗原MUC1-GST包被96孔板，每個樣本設雙復孔，4℃過夜。采用PBS-0.05%Tween-20洗板3次，加入封閉液封閉1.5 h后，洗滌2次，加一抗(待測血清)不同用藥組每只小鼠血清倍比稀釋(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000)，每孔100 μL，均設雙復孔，37℃孵育1.5 h。洗滌6次，加酶標二抗HRP(辣根過氧化物酶)(山羊抗小鼠 IgG，1∶10 000；山羊抗小鼠 IgG1，1∶4 000；山羊抗小鼠 IgG2a，1∶1 000)，每孔100 μL，37℃孵育1.5 h。洗滌7次，加入TMB，室溫15 min。加硫酸終止后，采用酶標儀于450 nm波長處測定A值。

1.7腫瘤預防實驗模型構建第3次免疫后1周，在小鼠右后背脅處接種黑色素瘤細胞B16-MUC1，每只2.0 × 106個。隔天稱體質量，用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑(a)和最小半徑(b)，計算腫瘤體積(V)：V=1/2ab2，直至第23天第1只小鼠死亡，觀察小鼠生存期。

2　結　果

2.1各組小鼠脾指數和淋巴細胞增殖反應MUC1-MBP+ BCG組和MUC1-MBP+ Tα1組小鼠脾指數明顯高于生理鹽水組(P< 0.01)。非特異性淋巴細胞增殖反應：MUC1-MBP+ BCG組和MUC1-MBP+ Tα1組SI均高于生理鹽水組(P< 0.05)，以MUC1-MBP+BCG組升高最為明顯。MUC1特異性淋巴細胞增殖反應：MUC1-MBP+BCG組和MUC1-MBP+Tα1組特異性SI均高于生理鹽水組(P< 0.05)。見表1。

表1各組小鼠脾指數、SI和特異性SI

GroupSpleenindexSISpecificSINormalsaline0．0039±0．00071．4570±0．35991．4290±0．1799MUC1?MBP+BCG0．0052±0．0017??2．2860±0．2249?1．9570±0．3599?MUC1?MBP+Tα10．0061±0．0008??1．9140±0．4981?1．8430±0．2699?

*P< 0.05,**P< 0.01vsnormal saline group.

2.2各組小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平與生理鹽水組比較，MUC1-MBP+BCG組小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ和IL-2水平明顯升高(P<0.05)；IL-4和IL-10水平略升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。與生理鹽水組比較，MUC1-MBP+Tα1組小鼠脾細胞培養上清中 IL-4水平明顯升高(P<0.01)；IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平升高,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2各組小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平

Tab.2Levels of IFN-γ,IL-2,IL-4 and IL-10 in culture supernatant of spleen cells of mice in various groups

GroupIFN?γIL?4IL?2IL?10Normalsaline152．90±49．4947．14±13．50145．00±44．9142．86±13．50MUC1?MBP+BCG471．40±135．00?72．86±17．99471．40±179．90?53．57±8．99MUC1?MBP+Tα1200．00±95．74113．10±44．99??185．70±89．9757．14±17．99

*P< 0.05,**P< 0.01vsnormal saline group.

2.3各組小鼠抗MUC1特異性抗體效價隨著Tα1劑量的增加，相應的抗體效價也有所提高，并且高劑量的Tα1能促進抗體的產生。見表3?？贵w亞類檢測結果顯示：Tα1能夠明顯誘導IgG1的產生，并且有劑量依賴關系，而IgG2a產生不明顯。見表4。

2.4各組小鼠生存期注射腫瘤細胞1周之內腫瘤生長緩慢，第8 天生理鹽水組最先觸及腫瘤結節，第11 天 MUC1-MBP+Tα1組觸及腫瘤結節，第14 天MUC1-MBP+BCG組觸及腫瘤結節。生理鹽水組小鼠生存期為 (26±4) d，MUC1-MBP+BCG組小鼠生存期為(28.7±6.3) d，MUC1-MBP+ Tα1組小鼠生存期為(28±6) d。見圖1。MUC1-MBP+BCG組和MUC1-MBP+Tα1組與生理鹽水組小鼠生存期比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3ELISA法檢測免疫小鼠抗MUC1特異性抗體效價

Tab.3Anti-MUC1 specific antibody titers in serum of immunized mice detected by ELISA

Antigen(MUC1?MBP)(50μg)　　Tα1(μg)Titerofantibody　--0　+-　1∶500-1∶1000　+15　1∶500-1∶2000　+301∶1000-1∶4000　+601∶4000-1∶8000

表4間接ELISA法檢測MUC1特異性抗體亞型

Tab.4Subtypes of MUC1 specific antibodies detected by indirect ELISA

GroupIgG1IgG2aIgG1/IgG2aA0．0484±0．00040．0498±0．00100．9631±0．0205B0．9871±0．0008?0．0481±0．000820．6300±0．4359C3．6320±0．0256??0．0515±0．001972．4700±0．6094D3．7980±0．0800??0．0575±0．000466．6000±2．2710E1．8380±0．1255??0．6089±0．00712．9460±0．2863

*P< 0.05,**P< 0.01vsA group.A:Control; B:MUC1-MBP (50 μg); C:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1(5 μg);D:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1(130 μg);E:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1 (60 μg).

3　討　論

本文作者將BCG與MUC1-MBP聯合作為陽性對照組，并與Tα1聯合MUC1-MBP免疫C57BL/6小鼠進行對比。本研究免疫活性檢測結果顯示：MUC1-MBP+ BCG組和MUC1-MBP+Tα1組小鼠脾指數、有絲分裂原SI、MUC1多肽特異性SI均有所升高，說明MUC1-MBP聯合Tα1和聯合BCG均可誘導非特異性淋巴細胞增殖和特異性淋巴細胞增殖。由于CTL殺傷活性離不開Th1的輔助，因此，本文作者分析了誘導活化的Th類型。采用MUC1多肽刺激5 d，檢測了脾臟特異性T淋巴細胞分泌的細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平，結果顯示：MUC1-MBP聯合Tα1明顯提高了IL-4和IL-10的分泌，而聯合BCG提高了IFN-γ和IL-2的分泌水平，提示Tα1誘導MUC1特異的Th2型應答，而BCG卻誘導MUC1特異的Th1應答，該結果與本文作者前期的研究[15-18]結果一致?？贵w的產生提示體液免疫應答的激活，也提示Th2的活化。而且，IgG1在IL-4誘導下才能產生，IgG2a在IFN-γ誘導下產生，因此檢測IgG1和IgG2a能間接提示Th2和Th1應答。本文作者進一步通過ELISA法檢測對免疫小鼠的血清IgG和亞類IgG1和IgG2a進行分析，結果發現：當免疫3次后，與MUC1-MBP組比較，MUC1-MBP+ Tα1組產生了較高效價的MUC1特異性IgG，并隨著Tα1劑量增加而升高，提示Tα1在促進MUC1-MBP產生體液免疫應答中有佐劑作用。進一步檢測抗體亞類結果發現：隨著Tα1劑量的增加，IgG1抗體的產生能力逐漸增強，而IgG2a未見產生，進一步提示Tα1誘導MUC1特異性Th2應答。

A:Tumor growth situation; B: Survival time curve.

Fig.1Tumor growth and survival curves of tumor-bearing mice in various groups 23 d after inoculation

Th1應答不僅輔助CTL的殺傷，而其本身釋放的IL-2、IFN-γ和TNF-α在治療腫瘤中發揮重要的作用，Th2應答主要輔助體液免疫應答產生抗體，抗體在腫瘤治療早期發揮作用，到晚期不僅發揮不了抗腫瘤作用，可能還會起到相反的作用[19-21]。因此，本文作者采用荷瘤鼠模型，深入探討了Tα1聯合MUC1-MBP抗腫瘤作用。本文作者將小鼠免疫3次后，給小鼠注射穩定轉染MUC1的黑色素瘤細胞B16-MUC1，結果顯示：Tα1聯合MUC1-MBP作用下腫瘤生長在早期較對照組緩慢，而到后期與對照組無明顯差別，未明顯延長小鼠生存期，與本文作者的預期一致。而MUC1-MBP+BCG組作為陽性對照組也未見明顯延長生存期，考慮可能是BCG活疫苗本身不穩定導致，其誘導產生的Th1應答強度較低，不足以誘導有效的抗腫瘤應答。

綜上所述，Tα1促進MUC1-MBP誘導產生特異性Th2應答，明顯促進體液免疫應答的產生，具有佐劑作用。Th2型應答的佐劑不適合應用于治療性疫苗，但適合用于預防性疫苗。本研究結果也提示在臨床中使用Tα1應該慎重，盲目應用有可能產生相反的作用。

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