五味子多糖對腦腫瘤干細胞的凋亡誘導及生長抑制作用

丁振東，張玉影，張　宇，鐘　越，溫　娜，于洪泉，齊　玲

(1.吉林大學第一醫院神經外科, 吉林 長春 130021; 2. 吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室,吉林 長春 130021;3. 吉林醫藥學院病理教研室, 吉林 吉林 132013)

腦腫瘤因位于顱內，所處位置極為特殊，一旦發生腫瘤就會對患者的生命產生嚴重的威脅，同時，也使患者的生活質量明顯下降，更給家庭帶來了沉重的經濟負擔[1]。近年腫瘤生物學研究[2-3]顯示：腦腫瘤中存在的一小群干細胞是其發生、復發及耐藥的源頭，目前對其仍缺乏有效的治療藥物。本課題組此前研究[4]發現：五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharide, SCP)和五味子木脂素均能明顯抑制膠質瘤細胞生長，且SCP作用于腦腫瘤干細胞(brain tumor stem cells，BTSCs)的機制尚未見相關文獻報道。因此本文作者觀察SCP對BTSCs生長的作用，且初步闡明其作用機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器SCP(中國藥品生物制品檢定所)，DMEM/F12細胞培養液、神經培養基、B27和小牛血清(美國Gibco公司)，CD133免疫磁珠(美國Miltenyi Biotec公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)(英國PeproTech公司)，木瓜蛋白酶(美國Worthington DBA公司)，二甲基亞楓(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美國Sigma公司)，Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體(北京中杉公司)。CB150型CO2培養箱(德國Binder公司)，PLUS 384型全自動酶標儀(美國MDC公司)，Ⅸ-70型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2細胞培養和觀察人腦腫瘤組織由吉林大學第一醫院神經外科提供，病理診斷均為Ⅲ-Ⅳ級腦膠質瘤。將瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，置入15 mL離心管中，加木瓜蛋白酶10 mL混勻，置37℃水浴45 min，其間不時振蕩，3 mL卵類黏蛋白液終止反應。反復吹打，300 g離心5 min，再加入紅細胞去除液振蕩10 min。再次離心后將細胞用無血清培養液洗滌(神經培養基加入B27、EGF和bFGF均為20 μg·L-1)，離心后重懸細胞，臺盼藍計數后將細胞以2×106·25 cm2密度種于培養瓶中，5% CO2、37℃、飽和濕度下培養過夜。

1.3 CD133免疫磁珠篩選BTSCs次日收集細胞將其吹打成單細胞后用70 μm濾器過濾，計數活細胞。用分選緩沖液進行細胞洗滌，800 g離心3 min，將細胞用300 μL分選緩沖液重新混勻后加入CD133免疫磁珠100 μL，4℃避光孵育30 min，緩沖液再次洗滌，800 g離心10 min，棄上清后緩沖液進行細胞重懸。500 μL緩沖液進行分選柱沖洗，細胞懸液壓力過柱，反復用緩沖液沖洗分選柱3次，移分選柱出磁場，最后用1 mL緩沖液洗先選柱，用泵加壓，收集的洗液為CD133+細胞，即BTSCs。

1.4檢測干細胞表面抗原收集生長的神經球，800 g低速離心3 min，PBS液洗滌沉淀，將神經球轉移至1.5 mL離心管中，4% 多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透細胞。5%驢血清室溫封閉1 h，一抗(Nestin 1∶200；CD133 1∶100)4℃過夜，加入相應的二抗(Tex-Red或FITC 1∶200)，室溫下避光孵育1 h。DAPI染核后封片，次日用熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.5細胞生長能力分析將BTSCs制成單細胞懸液，按細胞密度為5×103個/孔接種于96孔板，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養過夜。次日，加入SCP(用含5%小牛血清的培養基配制，濃度分別為0、200、400和800 μg·L-1)，每組設5個復孔，加藥24 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續在培養箱中孵育4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻后酶標儀檢測各孔490 nm處吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(用藥組A值/對照組A值)×100%。

1.6細胞凋亡率測定將BTSCs機械分離成單細胞懸液，將細胞以5×105個/孔密度種于6孔板中，置于5%CO2、37℃培養箱中過夜。實驗分為對照組(0 μg·L-1)和SCP組(藥物濃度為800 μg·L-1)，作用24 h后離心收集細胞。PBS 洗滌細胞后，用1∶4 binding buffer 緩沖液190 μL重懸細胞，調整細胞濃度，加入FITC標記的Annexin Ⅴ FITC 5 μL和20 mg·L-1PI 10 μL，置冰上10 min，流式細胞儀檢測各樣品中每10 000個細胞中的凋亡細胞，計算細胞凋亡率，軟件分析得出結果。

1.7各組BTSCs中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達各劑量SCP作用于BTSCs，留取上清液，將包被液與上清1∶1比例包被，4℃過夜，次日封閉后加入Bax、Caspase-3、Bcl-2(1∶1 000)，4℃過夜。加入二抗(1∶1 000)，37℃水浴1 h，顯色自動酶標儀490 nm處測定A值。以A值表示Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平。

2　結　果

2.1神經球CD133和Nestin表達情況CD133免疫磁珠分選后的細胞在培養液中呈懸浮生長，約6 h開始形成小神經球，隨培養時間延長神經球逐漸增大，約3 d形成典型的神經球。免疫熒光染色法檢測CD133和Nestin表達顯示：神經球中CD133和Nestin均呈明顯陽性表達。見圖1(插頁五)。

2.2各組BTSCs的增殖率與對照組比較，200、400和800 mg·L-1SCP組SCP作用于BTSCs 24 h時，BTSCs的增殖率下降，尤其400和800 mg·L-1SCP組細胞增殖率明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1各組 BTSCs的增殖率

GroupDose(mg·L-1)ProliferationrateControl0100．00±3．77SCP20086．79±9．2040077．35±7．43?80073．58±7．41?

*P<0.05 compared with control group.

2.3各組BTSCs的凋亡率800 mg·L-1SCP組SCP作用BTSCs 24 h時，細胞凋亡率為(9.28±2.35)%，與對照組(0.00%±0.27%)比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A:Control group;B:800 mg·L-1 SCP group.

Fig.2Apoptotic rates of BTSCs in various groups detected by flow cytometry

2.4各組BTSCs中凋亡相關蛋白表達水平ELISA法檢測結果顯示：與對照組比較，各劑量SCP組BTSCs中Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)，800 mg·L-1SCP組Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)，各劑量SCP組Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)。與對照組比較，各劑量SCP組Caspase-3蛋白表達水平升高，800 mg·L-1SCP組差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2各組BTSCs中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平

GroupDose(mg·L-1)BaxBcl?2Bax/Bcl?2Caspase?3Control　00．71±0．062．34±0．100．31±0．061．60±0．48SCP2001．26±0．04?2．20±0．020．57±1．28?1．73±0．494001．41±0．09?2．18±0．260．64±0．03?1．75±0．258001．42±0．07?1．55±0．01?0．91±0．05?2．05±0．48??

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

3　討　論

膠質瘤是中樞神經系統最為常見的原發性腫瘤，惡性程度極高[5]。近年來，惡性腫瘤發病率呈逐年上升的趨勢，在腦腫瘤中以惡性膠質瘤發病率的升高最為明顯[6]。一項多中心進行的分類調查[7]表明：中國的原發性腦腫瘤發病率為22.52/10萬。其中，腦膠質瘤占29.78%。因此，如何有效地控制甚至治愈膠質瘤是亟待解決的難題。

五味子是一種五味俱全、五行相生的果實，其能對人體五臟——心、肝、脾、肺及腎發揮平衡作用。有研究[8]顯示：五味子抗腫瘤活性主要集中在木脂素和多糖成分。20世紀90年代，眾多學者從五味子水溶液中分離得到SCP，并對其藥理活性進行了研究，發現其在保肝、提高免疫力、抗疲勞和抗腫瘤等[9-13]方面有廣泛的應用前景。黃玲等[9]研究SCP抑瘤率及其對免疫器官的影響發現：SCP能抑制S180荷瘤的增長，并且呈現劑量依賴關系，抑瘤率可以達到74.5%。雖然已有SCP抗腫瘤的相關報道，但尚未見有關SCP對BTSCs生長的作用和機制的研究報道。

本課題組分離、提取原代腦膠質瘤細胞，利用CD133免疫磁珠分選法獲得CD133+細胞，并進行神經球干細胞表面標記物CD133和Nestin檢測，證實所用細胞為BTSCs。不同劑量SCP作用BTSCs時：200、400和800 mg·L-1SCP均可以抑制細胞的生長，尤其400和800 mg·L-1SCP組BTSCs的增殖率明顯下降。以上結果表明：不同劑量SCP均可抑制BTSCs的生長，并且呈現明顯的劑量效應。

細胞凋亡是廣泛存在于生理和病理狀態下的有序的受一系列基因嚴格控制的程序化死亡，是級聯式基因表達的結果，腫瘤的發生可能是腫瘤細胞凋亡受阻所致[15-16]。本課題組采用Annexin Ⅴ-PI分析BTSCs凋亡率發現：與對照組比較，800 mg·L-1SCP組細胞凋亡率明顯升高；表明SCP可以誘導BTSCs發生凋亡。目前，在細胞凋亡研究中占主要地位的有2個信號途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑[14]。在線粒體途徑中Bax與Bcl-2始終倍受關注，兩者的比值決定了細胞是否發生凋亡[17-19]。而Caspases家族是凋亡的主要執行者，其中，Caspases-3是其中最為關鍵的因子之一，其負責對凋亡最后階段的關鍵性蛋白的酶切[20-22]。本實驗結果顯示：隨著SCP劑量的升高，各劑量SCP組細胞中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平減少，Bax/Bcl-2比值升高。因此SCP通過上調Bax/Bcl-2的比值促使BTSCs促凋亡因子占優勢，活化Caspase-3增加，引起BTSCs發生凋亡，從而抑制了BTSCs的生長。

本實驗針對五味子中抗癌多糖成分，研究SCP對BTSCs生長的抑制作用。通過研究發現其可劑量依賴性地抑制BTSCs的增殖。進一步研究發現：SCP誘導BTSCs凋亡可能是原因之一。但SCP抑制BTSCs的機制還需要深入研究。

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